抗壞血酸含量的測定

一、原理

還原型抗壞血酸（AsA）可以把鐵離子還原成亞鐵離子，亞鐵離子與紅菲咯啉（4,7-二苯基-1,10-菲咯啉，BP）反應形成紅色螯合物。在534nm波長的吸收值與AsA含量正相關，故可用比色法測定。脫氧抗壞血酸（DAsA）可由二硫蘇糖醇（DTT）還原成AsA。測定AsA總量，從中減去還原型AsA，即為DAsA含量。

二、儀器與用具

離心機；分光光度計；研缽；試管。

三、試劑

5%三氯乙酸（TCA）；20%TCA；無水乙醇溶液；0.4%磷酸－乙醇溶液；0.5%BP－乙醇溶液；0.03%FeCl3－乙醇溶液；0.6g/L DTT；Na₂HPO₄－NaOH溶液：以0.2mol/L Na₂HPO₄和1.2mol/L NaOH等量混合；60mmol/L DTT－乙醇。

四、方法

1. 制作標準曲線配制濃度為2mg/L，4mg/L，6mg/L，8mg/L，10mg/L，12mg/L，14mg/L的AsA系列標準液。取各濃度標準液1.0ml于試管中，加入1.0ml 5%TCA、1.0ml乙醇搖勻，再依次加入0.5ml 0.4%H₃PO₄－乙醇、1.0ml 0.5%BP－乙醇、0.5ml 0.03%FeCl₃－乙醇，總體積5.0ml。將溶液置于30℃下反應90min，然后測定A534。以AsA濃度為橫坐標，以A534為縱坐標繪制標準曲線，求出線性方程。

2. 提取取植物葉片1.0g，按1∶5（W/V）加入5%TCA研磨，4000r/min離心10min，上清液供測定。

3. 測定

（1）AsA測定取1.0ml樣品提取液于試管中，按上述相同的方法進行測定，并根據標準曲線計算AsA含量。

（2）DAsA測定向1.0ml樣品液中加入0.5ml 60mmol/L DTT－乙醇溶液，用Na₂HPO₄－NaOH混合液，將溶液PH調至7~8，置于室溫下10min，使DAsA還原。然后加入0.5ml 20%TCA，把PH調至1~2。按AsA相同方法進行測定，計算出總AsA含量，從中減去AsA，即得DAsA含量。