抗生素檢測方法的研究概況

　　摘要: 綜述了近年來檢測微量抗生素的幾種常見方法，其中包括高效液相色譜法，超高效液相色譜 － 串聯質譜法，酶聯免疫法，微生物檢測法，分光光度法和電化學分析法。闡述了各種方法的優缺點，并對今后抗生素檢測的便捷方法進行了展望，希望建立一種高效簡便的方法檢測殘留抗生素，以達到保障食品、藥品安全，保護綠色生態環境，開發新技術和新型傳感器的目的。

　　關鍵詞: 抗生素； 檢測方法； 概況

　　自 1929 年英國細菌學家 A．Fleming發現青霉素一類抗生素以來，抗生素便由于其對病原微生物的抑制或殺滅作用而廣泛應用于預防和治療感染性疾病。其在畜牧養殖業、臨床醫學、水產養殖等多個領域都極為常見，實用性也較強。我國對于抗生素的使用量以及生產量都位居世界前列。隨著抗生素廣泛的應用，一些弊端和威脅也開始出現。在臨床中，抗生素可以用于治療感染性疾病，但是抗生素的使用不當會造成人體的神經系統、腎臟、血液有不同程度的損傷，更有可能導致人體的死亡。在畜牧養殖業中，例如奶牛飼養，飼養者常常為了預防奶牛感染疾病，以獲得優質的牛奶，便會在其飼料中添加抗生素； 為了避免奶制品的腐壞，也會在牛奶中加入抗生素，這些都會引起抗生素在牛奶中的殘留，長期飲用含有抗生素的牛奶會對人體造成極大的損害。并且畜禽僅能吸收少量抗生素，多余的抗生素會隨著糞便排泄到動物體外，會對環境，土壤等造成巨大的危害，對生態系統的損害是無法預計的； 抗生素的濫用情況始終威脅著人類的生存與發展，現在已成為一種新型環境污染物，其污染問題也逐漸引起人們的關注； 因此殘留抗生素的檢測成為化學領域的熱點和難點。

　　截止目前為止，抗生素的檢測方法主要有高效液相色譜法，超高效液相色譜 － 串聯質譜法，微生物檢測法，酶聯免疫法，分光光度法，電化學法等。

　　1 抗生素常用檢測方法

　　1.1 高效液相色譜法

　　高效液相色譜法又被稱為高壓液相色譜法，此法是將液體流動相和極性具有差異性的化合物質加入到高效液相色譜柱中，在柱內將樣品的各組分分離，從而達到檢測抗生素目的。

　　潘曉東等采用乙腈作提取劑，探究了甲酸對流動相的影響。實驗取三個不同濃度的樣品放入色譜柱進行梯度洗脫和分離，根據色譜的保留時間來確定樣品中是否含有被測抗生素，并對樣品進行分析。由此檢測出豬肉當中的 β － 內酰胺類抗生素的標準曲線具有良好的線性關系。王余磊等以乙腈和磷酸二氫鈉溶液為流動相檢測抗生素，在棕色瓶中用甲醇溶液將標準溶液 TC、OTC、CTC 分別定容到 10 mL，在樣品經超聲、離心、過濾等步驟后放入高效液相色譜中，檢測結果表明樣品雞肉中的

　　土霉素，金霉素和四環素均具有良好的線性關系，土霉素、金霉素和四環素的最低檢出限分別為 20，100，20 μg·kg^-1。

　　高效液相色譜法具有高速度、高效率、高靈敏度等優點。但是高效液相色譜法費用昂貴、操作復雜、重復性不好、檢測限也偏高，在檢測時也會出現假陽性等問題。

　　1.2 超高液相色譜法

　　超高效液相色譜 － 串聯質譜法被廣泛應用于各個領域以檢測抗生素。李倩瑩等采用電噴霧離子化，多反應檢測模式和負離子掃描對抗生素進行檢測。實驗將5.0g 水產品試樣進行離心、震蕩、凈化等步驟后制備標準曲線，實驗表示其在 0.1～10 ng·mL－1范圍內具有良好的線性相關系數，相關系數為 0．999 2。此法優化了濃縮和提取溶劑的用量方式，也優化了檢測的色譜及質譜條件，從而達到預期檢測效果。李宏亮等檢測了尿中痕量的 14 種 β－內酰胺類抗生素，以色譜柱，乙酸銨的水-甲醇溶液作為流動相進行梯度洗脫，以酶消解提取、固相萃取凈化、正離子掃描等多種檢測模式對樣品進行處理。結果檢測其中12種β－內酰胺類抗生素均具有良好的線性范圍。

　　超高效液相色譜－串聯質譜法對樣品的流速要求極高。流速太快會導致回收率低； 流速太慢則會導致樣品處理效率很差，會出現基質效應影響不明顯等情況。

　　1.3 酶聯免疫法

　　酶聯免疫法是讓抗體或者抗原和酶復合物結合，通過顯色來檢測被測物含量的方法。劉宏梅等人采用酶聯免疫吸附法測定家禽配合飼料中氯霉素的含量，飼料經乙酸乙酯和正己烷處理后，取下層水樣作為樣品進行分析，在測定氯霉素標準曲線時，添加 TMB 作為顯色底物； 以吸光度為縱坐標，不同濃度標準樣品的氯霉素為橫坐標，再根據吸光度值和氯霉素含量呈負相關的關系便可判斷出其氯霉素的含量。該方法可以用于基層工作中的大規模篩選氯霉素的含量。區兌鵬等采用特異性強的間接酶聯免疫法同時檢測多種抗生素，建立水產品的多種藥物殘留量的快速檢測分析方法。樣品經 0.1mol /L 鹽酸處理，60 ℃孵育 2 h，再由乙酸乙酯提取，使用酶聯免疫試劑盒檢測其抗生素含量。通過顯色，可以直觀的進行定性判斷； 通過酶標儀，可以對六種物質進行定量分析。而且它的靈敏度和準確地滿足日常的大量水產品的初步批量檢測，縮短了檢測時間，簡化實驗過程，提高了效率。

　　酶聯免疫法靈敏度高、特異性強、重復性好，但是它的操作步驟較多，要求操作者操作熟練。

　　1.4 微生物檢測法

　　微生物檢測法主要是通過觀察微生物的生命活動來對抗生素進行檢測，主要是根據被測樣品中產生的抑菌圈的大小來判斷樣品中抗生素的殘留狀況。是一種定性或定量分析的方法。高曉月等用微生物顯色法，以大腸埃希氏菌為指示菌，

　　檸檬酸-丙酮為緩沖溶液，使其蛋白沉淀，并且其上清液的狀態為無色透明，便于觀察。該方法可用于畜禽肉中喹諾酮類、氨基糖苷類抗生素殘留的檢測，其檢測限低于我國的規定值，并且該方法的準確性較高，沒有假陰性結果的存在。陸其聰等通過觀察菌種的生長情況來判斷試樣中葉酸含量的多少，用 5mg/mL 的抗壞血酸將磷酸鹽緩沖溶液的 pH 值調至 6.8，再將鼠李糖乳桿菌接種到培養皿中，培養一段時間后測定其吸光度，根據標準的吸光度值曲線可以計算出試樣中葉酸的含量。

　　微生物檢測法可以直觀、特異性地反映抗生素的抗菌活性，但培養基的質量、原材料的種類、儀器的潔凈程度等都會對實驗造成不小的影響。

　　1.5 分光光度法

　　分光光度法是一種利用吸收光譜對物質進行分析處理的方法。李振等測定頭孢噻呋鈉的含量采用的就是紫外分光光度法，首先準確稱取頭孢噻呋鈉加入醋酸銨中進行溶解，然后測定其濃度，結果曲線呈現了良好的線性關系。劉榮森等在 100 ℃下，借助頭孢曲松鈉將 Fe( Ⅲ) 還原成 Fe( Ⅱ) ，使其與鄰二氮菲進行反應。根據形成的橘紅色配合物情況對頭孢曲松鈉含量進行測定，結果顯示頭孢曲松鈉濃度在最大吸收波長處呈良好線性關系。劉榮森等在此方法的基礎上又將頭孢唑啉鈉放入氫氧化鈉溶液中將其降解為含巰基化合物，然后加入適當的 FeCl₃ 生成可溶性普魯士藍，通過對普魯士藍最大吸收波長處的吸光度測定，從而檢測出抗生素含量。結果表明頭孢唑啉的鈉含量具有良好的線性范圍。

　　分光光度法儀器操作簡單、費用低，但是此實驗對樣品條件、測量濃度要求極高，會耗費大量時間，并且測定的結果不準確。

　　1.6 電化學分析法

　　電化學分析法是根據電化學池內溶液的化學性質和被測物性質進行分析的一類分析方法。其基礎是電化學反應，應用電化學原理和技術，使電解質溶液和電極外接電路構成電化學池而發生反應。主要方法有電導法、電位滴定法、電解分析法、伏安法和電位溶出法。匡云飛等為進一步探索出準確度高和抗干擾性能強地檢測氯霉素的方法，采用三電極體系，利用石墨烯和碳納米管復合修飾玻碳電極為工作電極，以鉑絲電極為輔助電極，甘汞電極為參比電極檢測氯霉素的含量。實驗選用 0.2 mol/L PBS 緩沖溶液作為支持電解質溶液，調節 pH 值為6.6～8.0之內，觀察其電化學響應。結果顯示該電極的檢出限為 0.05 μmol/L，可用于藥物中氯霉素的快速檢測。許賀等以電解石墨棒的方式來制備石墨烯量子點，將 Nafion 和石墨烯量子點復合修飾到玻碳電極上，以 TE 緩沖溶液為電解質溶液，掃速為 50 mV/s 對氯霉素進行電化學檢測。通過陽極溶出伏安法和示差脈沖伏安法來檢測氯霉素，檢出限為 1.67×10^-7mol/L。陳宏等以金屬有機材料鎳-均苯三酸和聚丙烯酸鈉混合修飾玻碳電極，采用循環伏安法對其進行檢測，其檢出限低于我國動物源性食品中殘留量的標準。

　　電化學檢測準確度高、選擇性強，抗干擾性能好，能迅速地檢測微量氯霉素的含量。

　　2 結語與展望

　　隨著抗生素廣泛應用于臨床醫學，畜牧養殖業等領域，其殘留情況也日益加劇，抗生素的殘留會對環境、土壤和人體等造成不小的危害。所以對于食品藥品、環境土壤方面抗生素殘留情況的實時檢測在食品保障、綠色生態環境保護方面都有重要意義。

　　以高效液相色譜法來檢測，其檢測速度和靈敏度都有一定的優勢，但是其檢測費用過于昂貴、操作復雜、檢測限高。以微生物檢測法和超高液相色譜法對抗生素的殘留狀況進行檢測，能夠直觀便捷地看到實驗結果，但是其限制條件過于多，操作過于復雜，實驗效果并不理想。像分光光度法，其儀器操作簡單，費用低，但是對儀器要求很高，并且準確性不高。電化學分析法操作簡單方便，靈敏度度高，選擇性強，抗干擾性能好，檢測限低，其準確性也優于其他方法。上述幾種方法對于抗生素的檢測都具有一定效果，但是也有一定的局限性。因此建立一種高效簡便的電化學方法來檢測微量殘留抗生素是我們研究的重點與方向。對于我們現實生活中抗生素的檢測、新技術和新型傳感器的開發等都具有重要意義。

文章來源：楊耀彬,劉爽,馮佳瑩,石小棉.抗生素檢測方法的研究概況[J].山東化工，2022，(12):106-107+114.