抗癆清肺顆粒HPLC特征圖譜及液質聯用分析

抗癆清肺顆粒HPLC特征圖譜及液質聯用分析

　　抗癆清肺顆粒由百部、橘絡、矮地茶、黃精、玉竹等7味藥組成，源于長沙市中心醫院的臨床經驗方，主要用于多耐藥性肺結核的治療。該制劑成分復雜，其中玉竹、黃精等含有較多皂苷及多糖類成分[1-2]，橘絡、矮地茶等含有較多黃酮類、香豆素類等成分[3-4]，百部的主要活性成分為生物堿類、糖類等[5]。本研究采用高效液相色譜法（HPLC）對該制劑的特征圖譜進 
　　基金項目：國家科技重大專項-重大新藥創制（2013ZX10005004- 003-001） 
　　通訊作者：夏新華，E-mail：xiaxinhua001@163.com 
　　行研究，為抗癆清肺顆粒的質量控制提供依據。 
　　1 儀器與試藥 
　　島津高效液相色譜儀（N3000色譜工作站，SPD- 10Avp檢測器，LC-10ATvp泵）；質譜儀（Agilent6530），配有Agilent1200液相色譜儀；SB-5200D超聲波清洗儀（寧波新芝生物科技股份有限公司，功率300 W，頻率50 Hz），XB-220A型電子分析天平（瑞士PRECISA）等。 
　　抗癆清肺顆粒10批，實驗室自制；橙皮苷（批號110721-201115），中國食品藥品檢定研究院；藥材飲片，購自湖南三湘中藥飲片有限公司；乙腈為色譜純，水為重蒸水，其他試劑均為分析純。 
　　2 方法與結果 　　2.1 色譜條件 
　　采用Kromasil C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），以乙腈（A）-1%醋酸水溶液（B）為流動相進行梯度洗脫（見表1），流速1.0 mL/min，檢測波長290 nm，柱溫30 ℃，進樣量20 μL，記錄時間120 min。 
　　2.2 質譜條件 
　　離子源為ESI源，一級全掃描，正負離子分別采集數據，霧化器壓力40 psi，毛細管電壓4 kV，干燥氣流量6 L/min，干燥氣溫度325 ℃，離子源溫度350 ℃。 
　　2.3 對照品溶液的制備 
　　精密稱取橙皮苷對照品適量，加甲醇制成濃度為0.28 mg/mL的溶液，即得。 
　　2.4 供試品溶液的制備 
　　取本品4.0 g，精密稱定，精密加入甲醇50 mL，稱定質量，水浴回流45 min，冷卻，稱定質量，用甲醇補足減失的質量，搖勻，過0.45 μm微孔濾膜，取續濾液，即得。 
　　2.5 各藥材溶液的制備 
　　精密稱取矮地茶、橘絡、黃精、玉竹等藥材粗粉適量，分別按“2.4”項下方法制備，即得。 
　　2.6 方法學考察 
　　2.6.1 精密度試驗 取供試品溶液，連續進樣6次，按“2.1”項下色譜條件進行測定，結果測得各共有峰的相對保留時間RSD為0.1%～1.4%，相對保留峰面積RSD為0.2%～3.0%，表明儀器精密度良好。 
　　2.6.2 重復性試驗 取同一批樣品4.0 g，共6份，按“2.4”項下方法制備供試品溶液，分別進樣，結果測得各共有峰的相對保留時間RSD為0.1%～0.7%，相對保留峰面積RSD為1.3%～3.0%，表明該法重復性良好。 
　　2.6.3 穩定性試驗 精密吸取同一供試品溶液，分別在0、3、6、9、12、24 h進樣，結果測得各共有峰的相對保留時間RSD為0.1%～1.0%，相對保留峰面積RSD為0.1%～2.7%，表明供試品溶液在24 h內穩定。 
　　2.7 特征圖譜建立及評價分析 
　　2.7.1 特征圖譜的構建與相似度評價 取樣品10批，分別按“2.4”項下方法制備供試品溶液，并按“2.1”項下色譜條件進行測定，記錄120 min的色譜圖。根據各樣品色譜圖所給出的峰數、峰面積積分值及相對保留時間，選取其中13個共有峰作為特征峰（見圖1）。采用國家藥典委員會《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2004 A）》對10批樣品的HPLC色譜圖進行相似度評價，即任選一樣品色譜圖作為參照圖譜，進行多點校正，自動匹配（時間窗寬度為0.10），用中位數法生成對照圖譜（共有模式圖），計算相似度。結果10批樣品色譜圖具有較高的相似度（>0.995），表明該制劑制備工藝穩定。 
　　2.7.2 共有特征峰的標定 選擇橙皮苷峰（10號峰，保留時間為70.67 min±0.12 min）為參照峰（S峰），將各共有峰的保留時間與S峰的保留時間進行比較，計算相對保留時間。10批抗癆清肺顆粒共有特征峰的平均相對保留時間分別為1號峰0.09、2號峰0.10、3號峰0.13、4號峰0.23、5號峰0.29、6號峰0.31、7號峰0.50、8號峰0.53、9號峰0.94、10號峰1.00、11號峰1.16、12號峰1.25、13號峰1.33。 
　　2.7.3 共有特征峰峰面積比 以橙皮苷峰（S峰）峰面積為1，計算各共有特征峰的峰面積與S峰峰面積的比值（相對峰面積）。結果10批抗癆清肺顆粒共有特征峰的平均相對峰面積分別為1號峰0.06、2號峰1.27、3號峰0.98、4號峰0.07、5號峰0.30、6號峰0.11、7號峰0.05、8號峰0.11、9號峰0.28、10號峰1.00、11號峰0.09、12號峰0.01、13號峰0.01。其中，2、3號峰與10號峰峰面積均占總峰面積的20%以上。 
　　2.7.4 共有特征峰的辨識與歸屬 取橙皮苷對照品溶液及矮地茶、橘絡、玉竹、黃精、百部等藥材溶液，按上述色譜條件進行測定。將各對照品、藥材圖譜與供試品特征圖譜進行比較（見圖2），通過考察各色譜峰的相對保留時間、峰形等，對供試品特征圖譜的共有峰進行辨識與歸屬。結果表明，1、3、5～7、9～12號峰的專屬性較強，其中1、5號峰為矮地茶的特征峰，3號峰為黃精的特征峰，6、7號峰為百部的特征峰，13號峰為玉竹的特征峰，9～12號峰為橘絡的特征峰群，可用于該制劑中上述藥材的定性鑒別；2、4、8號峰未找到歸屬，可能為該制劑在制備過程形成的新組分。 
　　2.7.5 共有特征峰成分分析 按照上述色譜和質譜條件，對供試品溶液進行HPLC-MS/MS分析。根據各色譜峰在正離子模式或負離子模式下獲得的一級質譜中的準分子離子（[M+1]+、[M+Na]+、[M-1]-）及其二級質譜的碎片離子所提供的信息，結合相關文獻[6-13]對特征圖譜中8個共有特征峰所表征的成分進行推測，結果見表2。 
　　3 討論 
　　本試驗考察了乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸、乙腈-1%醋酸不同流動相系統對特征圖譜的影響，結果以乙腈-1%醋酸流動相系統分離度好，基線平穩。分別在205、230、254、275、296、290、312 nm對供試品溶液進行檢測，結果顯示，在290 nm處，基線平穩，峰形良好，峰數較多，故選擇290 nm作為檢測波長。 
　　本試驗還分別考察了不同提取溶媒（無水乙醇、甲醇、80%甲醇、60%甲醇、80%乙醇）對樣品特征圖譜的影響，結果表明，以甲醇作為提取溶媒時，峰形和峰數均能得到滿意的效果。同時，分別考察了不同提取方法（超聲、水浴回流）對特征圖譜的影響，結果顯示，水浴回流提取更能充分溶出抗癆清肺顆粒中的有效成分，故采用回流提取45 min作為供試品溶液的制備方法。 
　　在各批樣品的指紋圖譜中，橙皮苷保留時間居中，峰面積占總峰面積的22.43%，故確定橙皮苷（10號峰）為參比峰（S峰），用于相對保留時間和相對保留峰面積的計算。該特征圖譜共有峰有13個，其中黃精、玉竹、矮地茶、橘絡都能與相應峰進行定位，但還有3個峰未能進行歸屬，其中2號峰吸收較強，可能為制劑在制備中形成的新組分。另外，該制劑中還有2味藥也未能找到歸屬（圖2中的藥材A、藥材B），可能與其在上述色譜條件下無明顯色譜峰有關。