朱偉杰,暨南大學生命科學技術學院生殖免疫研究所
精子的抗原性早在100多年前已被科學家所發現。奧地利學者Landsteiner和俄國學者Metchnikoff于1899年各自獨立試驗,將豚鼠精子同種免疫,證實了精子具有抗原性并能誘發出特異性抗體,而且抗體能夠抑制精子運動。1959年荷蘭學者Rümke和Hellinga首次發現不育男性血清中有抗精子抗體(antispermantibody,ASA),這些陽性血清使精子自發凝集。繼而,Franklin和Dukes在1964年報道不孕婦女血清的精子凝集陽性率明顯偏高,ASA與人類生殖的關系逐漸受到重視。業已證實,精子抗原可以在男性引起自身免疫(autoimmunization),在女性引起同種免疫(isoimmunization),在生殖道還存在局部免疫(localimmunity),ASA降低生育力,導致不育已為人們所認同。另一方面,盡管發現ASA已逾百年,世界衛生組織(WHO）于1987年的精液分析手冊(第2版)就建議不育癥夫婦作ASA篩查,但目前對ASA在機理、檢測、應用等諸多方面仍知之不多。例如,在生育領域,精子抗原引發ASA產生的確切機制尚未充分了解,個體受到(全)精子免疫,為什么誘發的抗體只針對精子頭或頸部、尾部甚至尾尖等多種類型;精子免疫也可能有細胞免疫參與,但相關研究甚少。在節育領域,雖然1937年美國就對精子為抗原的“精子毒性疫苗”授予了ZL,幾十年來亦報道了不少精子蛋白具有抗生育效應,但迄今還沒有動物實驗顯示一個單獨的精子抗原能導致動物受孕率100%下降,目前尚未有精子成分研制成的避孕疫苗可在臨床應用。在不育領域,雖然檢測了ASA幾十年,但實際上并不知道ASA處于何水平介導了不育,WHO于2010年頒布的精液分析手冊(第5版)給出ASA陽性的“臨界值”仍待證據。本文基于筆者三十多年的ASA檢測實踐及以往文獻審讀,對ASA介導不育的現狀進行評價,以期增進ASA與生殖效應相互關系的深入認識。
1、ASA的檢測
ASA的檢測及其結果是認識精子免疫介導不育的前提。理想的ASA檢測應該檢出ASA存在與否、抗體類型、滴度水平以及抗體在精子表面的結合位置,而且檢測方法須有高特異性、敏感度和重復性。盡管近三十多年發展的ASA檢測方法甚多,但每種方法均有一定的局限性。不同的檢測會有不同的結果判讀以及相應的臨床意義。此外,應用不同試劑廠商的產品,也會有不同的檢測結果。
WHO手冊推薦ASA檢測采用混合抗球蛋白反應試驗(mixedantiglobulinreactiontest,MAR試驗)或免疫珠試驗(immunobeadtest,IBT),以50%活動精子黏附有乳膠顆粒(或處理過的紅細胞)或免疫珠作為ASA陽性的臨界值。應注意的是,①WHO手冊建議ASA陽性的臨界值為50%活動精子黏附有乳膠顆粒或免疫珠,為什么不是40%或60%,實際上手冊中抗體陽性的臨界值僅是觀點而巳,尚待廣泛資料支持或修改;②WHO手冊的ASA陽性臨界值,1987年(第2版)的是10%,1992年(第3版)的是20%,1999年(第4版)和2010年(第5版)的是50%,抗體陽性臨界值如此遞增有何實驗和臨床依據？③男性的精子直接法檢測的臨界值是50%,女性的血清間接法檢測的也是50%,精子免疫在男、女體內誘發抗體的機制并不相同,而采用一樣的臨界值是否合理尚需證實;④ASA為兩類免疫球蛋白:IgG和IgA。這兩類抗體對精子功能的干擾是不相同的,那么,IgG抗體的臨界值是50%,IgA抗體的也采用50%,是否合理尚需實驗支持;⑤ASA可以存在于精子膜表面,或者存在于血清、睪網液、精漿、宮頸黏液、卵泡液,但它們的抗體來源或途徑并不相同,是否采用一樣的臨界值尚需研究;⑥雖然MAR試驗和IBT都是一樣的臨界值,但是,MAR試驗采用新鮮精液標本,而IBT采用洗滌過的精子,兩者的方法學不同,檢測結果并不總是一致的。故此,上述這些尚待認識的問題使得對ASA檢測結果與患者的生育障礙的關系仍需進行大量研究,而且應結合其它相關臨床和實驗室檢查作出慎重的解釋。
2、ASA對生殖的可能效應
ASA可以通過多種機制在不同環節干擾正常的生殖過程,造成免疫不育,但是,ASA抑制生殖活動的具體機制尚未真正了解。
2.1ASA對睪丸精子發生的影響
上世紀50年代以來,對以免疫機制破壞睪丸功能進行了研究,實驗性變態反應睪丸炎(experimentalallergicorchitis,EAO)可造成豚鼠、小鼠、兔等多種動物的精子生成缺乏,亦有采用睪丸勻漿加Freund佐劑注射于前列腺癌患者誘導出精子生成缺乏的報道,依此有觀點認為ASA損傷睪丸精子發生。但是,男性體內ASA對生精上皮的效應,與睪丸炎對精子發生的作用機制并不相同。在血清或精子表面檢出ASA陽性的不育男性,目前積累的資料包括本實驗室結果顯示,ASA不顯著干擾曲細精管內精子發生。有3方面的證據:①先天性雙側輸精管缺如患者,青春期啟動精子發生,即由于精子輸出通道缺乏而產生ASA,ASA在機體存在至成年生育期,這些患者的睪丸組織活檢多顯示正常或亞正常的生精上皮,睪丸取精后可使配偶建立妊娠,這表明ASA長期存在并沒有顯著抑制精子發生;②雙側輸精管結扎的男性,ASA通常在數周后就出現,而且會有較高的抗體滴度,但輸精管結扎的男性如果做復通術,可以檢出不低的精子總量,同時顯示較高的抗體水平但也沒有嚴重干擾精子的發生;③本實驗室檢測了多例雙側輸精管結扎超過30年的男性,結果其血清仍顯示有ASA(未發表資料),這說明睪丸仍有精子產生,亦間接表明即使ASA存在了30年也沒有導致精子生成缺乏。
2.2精索靜脈曲張與ASA
精索靜脈曲張癥可降低男性生育力。研究表明,精索靜脈曲張是男性不育的首位病因,發病率超過40%。精索靜脈曲張可造成多項精子參數異常,有報道認為,精索靜脈曲張不育患者會檢出高的ASA發生率,國內文獻甚至報告精索靜脈曲張患者的ASA發生率超過80%。本實驗室對精索靜脈曲張不育患者的大樣本檢測結果顯示,精索靜脈曲張不會引致ASA產生,而且對一組精索靜脈曲張患者長達20年的追蹤檢測亦表明,這組患者沒有檢測出ASA(未發表資料)。本實驗室對ASA檢出與其它文獻報道的不同,或許涉及不同的檢測方法學。
2.3流產與ASA
流產是妊娠常見的一種并發癥,病因復雜,與免疫因素有關。成功妊娠與否不僅取決于母-胎之間的免疫平衡,還涉及機體一系列免疫學機制參與調節。精子對女性是一個同種異體抗原,以往研究對ASA介導流產有不同見解。有報道認為,女性受精子免疫后,體內有ASA可增加流產的風險,國內一些文獻報道流產包括復發性流產者的ASA陽性率高于30%。另一方面,多項研究顯示,流產與ASA無關。本實驗室對流產者的ASA水平進行了檢測,62例發生了早期流產婦女的ASA均為陰性,大樣本及反復性流產者的ASA亦均為陰性(未發表資料),表明了流產不涉及ASA因素。可以推測:如果抗體能夠對宮腔內的胚胎(如此大的細胞團)發生效應,使得胚胎發育異常,導致胚胎死亡、妊娠終止,抗體水平需非常高,而抗體水平確實如此高,抗體則在胚胎發生之前的生殖活動就該起效了,即受精不會發生,不至于在形成了胚胎,而且胚胎發育了這么久(數十日)后,抗體才對胚胎內的精子成分作攻擊。
2.4ASA對宮腔內人工授精(IUI)的影響
IUI可以避免ASA對精子穿透宮頸黏液環節的影響,是治療ASA不育患者的一種療法。實際應用時,須考慮ASA的源性:男方的精子表面有ASA,還是女方宮頸黏液有ASA,或者是女方僅血清檢出ASA。不同的抗體源性會有不同的療效。女性局部尤其是宮頸黏液有ASA,可妨礙精子穿透宮頸黏液。這一效應取決于精子活力、精子濃度、抗體分子與精子表面抗原的親和力,以及抗體在精子上的附著部位(精子頭、尾,或兩者)。對這類患者的治療,采用IUI方式,將洗滌過的活動精子注入宮腔內,可以避開宮頸黏液對精子穿透的制約,但是,宮頸黏液若檢出較高水平的IgA抗體,需檢測血清循環抗體的狀態,后者也是制約IUI療效的因素。不育男性的精子表面結合有高水平的IgG抗體,亦多能檢出IgA抗體,精子在穿透宮頸黏液時會發生“顫動”現象,精子不再遷移,采用IUI是可嘗試的處理。然而,有些患者精子膜IgA抗體仍可干擾精子獲能、精-卵識別等其它生殖環節,部分患者的精子還合并其它影響受精的結構或功能缺陷,故采用IUI治療的效果也可能不大。本實驗室觀察到(未發表資料)僅血清檢出ASA的不育女性,排除了內分泌、輸卵管等因素外,處在陽性水平者施行IUI的療效不高,很可能生殖道腔內也有較高的抗體水平,從而抑制了精子功能,導致授精失敗。
2.5ASA對體外受精(IVF)的影響
IVF技術可以避開抗體的效應環節,是治療ASA不育患者的有效方法。女方體內有ASA,IVF避免了體內抗體對精子功能包括運動、存活、受精等的不良效應,而且還可以避免抗體對胚胎早期發育的影響,IVF有較好的療效。男方精子表面有ASA,既往大量文獻和本實驗室對ASA與IVF相互關系的研究顯示:①ASA陽性組的受精率低于正常對照組;②膜表面抗體陽性的精子極少達到100%,總有部分精子沒有抗體或結合的抗體水平較低,這些精子可具有正常授精能力,也能使卵子受精,即僅ASA的原因,一般情況下不會出現受精率為0。這2點提示:施行IVF療法不能完全避免精子膜抗體對一些受精事件的影響,不過仍可以獲得一定受精率以達到治療的效果。
2.6ASA對卵胞質內精子注射(ICSI)受精的影響
ICSI治療ASA不育患者可以獲得較好的效果,受精率較IVF的高。值得注意的是,對精子表面有ASA(例如,雙側輸精管先天性缺如患者或精道后天梗阻患者,這些患者體內有一定水平的ASA,其附睪精子表面會有ASA),ICSI注射精子的同時,實際上也將精子膜表面結合的IgA和IgG抗體帶入了卵胞質內,可能引致ICSI受精后的胚胎碎片增多、胚胎發育不良。涉及的原因是多方面的,其中與某些精子膜蛋白抗體不影響受精卻影響受精后胚胎發育有關,也可能原先附著在精子膜上的抗體蛋白隨著精、卵原核融合而分布在合子核膜或合子細胞膜,或在合子細胞內,抗體蛋白與合子表達的蛋白發生相互作用,逐漸干擾了合子細胞或胚胎的正常代謝,導致發育異常。
若女性體內存在高滴度ASA,尤其是女性生殖道存在分泌型IgA抗體,即使經IVF或ICSI獲得了受精卵,但胚胎移植后,女性體內高滴度的ASA在理論上還可能干擾胚胎發育:①在著床前胚胎發育過程,胚胎可能表達有一些與精子有交叉反應的胚胎抗原,女性體內的ASA會與這些胚胎抗原相互作用,導致胚胎發育異常和著床失敗;②已被精子致敏的婦女,其體內ASA可以通過刺激活化的淋巴細胞釋放出細胞毒性淋巴因子,間接影響胚胎發育。故此,這類不孕婦女實施輔助生育治療前,宜先降低其體內ASA水平,或者延長體外胚胎的培養時間,至胚胎發育晚些階段再移植回體內,或許可以改善IVF成功率。
3、當前對ASA介導不育的認識偏差
ASA介導免疫不育的關系非常復雜,目前認識仍然有限。當前對ASA介導不育的認識偏差主要有以下問題:
3.1未認識ASA產生的前提
男性于青春期才開始在睪丸曲細精管管腔內有精子產生,故精子蛋白對男性機體免疫系統來說是“外來抗原”;女性發生性交可受到精子免疫,多次性交則可視作反復注入異體抗原的過程。但是,正常情況下,精子在男性體內不引起自身免疫反應,女性也不會因性交而對精子抗原產生抗精子的免疫反應,這是由于男、女性體內有多重免疫防御機制,避免了精子自身免疫或同種免疫反應的發生。如果免疫防御機制受到破壞或失平衡,使得精子及其可溶性抗原暴露于機體免疫系統,而且精子抗原是大劑量、持續地刺激免疫系統,才可能激起對精子發生免疫反應,產生一定水平的ASA。所以,存在足量精子、免疫防御機制異常、精子持續作用于免疫系統,這三者是產生ASA的前提。有些研究未清晰認識ASA產生的前提。例如,有幾項報道對1~8歲的男孩可檢出不低的ASA發生率,實際上這些幼齡男童遠未進入青春期,睪丸是沒有精子生成的,檢出的ASA是何來源尚待證實。還有一些文獻報道,吸煙、非生殖系統炎癥、海拔、氣候等也會引致ASA陽性,而且發生率高。似乎很多因素都可以導致ASA產生,并且介導了不育,事實上并非如此。
3.2夸大了ASA對生殖環節的抑制作用