抗藥性突變株的分離實驗

實驗方法原理 生物的抗藥性突變是 DNA 分子的某一特定位置的結構改變所致，與藥物的存在無關，某種藥物的存在只是作為分離某種抗藥性菌株的一種手段，而不是作為引發突變的誘導物，因而在含有一定抑制生長藥物濃度的平板上涂布大量的細胞群體，極個別抗性突變的細胞會在平板上長成菌落。將這些菌落挑取純化，進一步進行抗性試驗，就可以得到所需要的抗藥性菌株，抗藥性突變常用作遺傳標記，因而掌握分離抗藥性突變株的方法是十分必要的。

為了便于選擇適當的藥物濃度，分離抗藥性突變株常用梯度平板法。本實驗擬用梯度平板法分離大腸桿菌抗鏈霉素突變株。制備梯度平板如圖所示。先倒入不含藥物的底層培養基，把培養板斜放（圖 1，A），凝固后將平板平放，再倒入含有鏈霉素的上層培養基（圖 1，B），這樣便可得到鏈霉素濃度從一邊到另一邊逐漸降低的梯度平板。在此平板上涂布大量敏感菌（或經誘變處理的菌株），經培養后，在鏈霉素濃度比較高的部位長出的菌落中可分離到抗鏈霉素突變株。

實驗材料 大腸桿菌

試劑、試劑盒 鏈霉素LB 液體培養基10 ml 瓊脂培養基試管

儀器、耗材 1 ml 無菌吸管盛有 70％ 乙醇的燒杯玻璃涂棒水浴鍋

實驗步驟

1. 接種大腸桿菌于盛有 5 ml 液的試管中，37℃ 振蕩培養 24 h。

2. 在熱水浴中溶化 LB 瓊脂培養基。

3. 倒 10 ml 已溶化的不含藥物的 LB 瓊脂培養基于一套無菌培養皿中，立即將培養皿一端墊起，使瓊脂培養基覆蓋整個底部并使培養基表面在墊起的一端剛好達到培養皿的底與邊的交界處，讓培養基在這一傾斜的位置凝固（圖 1，A）。

4. 在已凝固的平板底部離瓊脂這一邊標上「低」，并放回水平位置，然后再在底層培養基上加入每毫升含有 100 ug 鏈霉素的 LB 瓊脂培養基 10 ml，凝固后，便制得一個鏈霉素濃度從一端的 0 ug／ml 到另一端的 100 ug／ml 的梯度平板。

5. 用 1 ml 無菌吸管吸取 0.2 ml 大腸桿菌培養液加到梯度平板上，用無菌玻璃涂棒將菌液涂布到整個平板表面。

如果用蘸有乙醇并經火焰滅菌的玻璃涂棒，可在火焰旁或伸進平板，在板蓋上稍事冷卻，以免燙死細胞。

6. 把平板倒置于 37℃ 培養 48 h。

7. 選擇 1～2 個生長在梯度平板中部的單個菌落，用無菌接種環接觸單個菌落朝高藥物濃度的方向劃線。

8. 把平板倒置于 37 ℃ 培養 48 h。