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  • 發布時間:2019-04-11 14:41 原文鏈接: 報告基因實驗——花青素表達的定量

    實驗材料

    植物組織

    試劑、試劑盒

    酸性乙醇或甲醇花青素-3-O-葡萄糖苷

    儀器、耗材

    濾膜

    實驗步驟

    1. 瞬時表達研究

    植物組織經基因槍轉化培養大約 12 h 后,轉化細胞開始表現出深紅色或者偶爾為深藍色的斑點。顏色常常會向整個液泡擴散,從外表上看整個細胞都是紅色的。在幾天時間里,顏色將會增強,并且能在 1~2 周內保持穩定。對于有些細胞來說,其深色液泡內含物中的花青素或者 AVI [ 27 ] 會隱退,或者隨著時間的推移慢慢地沉積下來,在這種情況下個體轉化細胞更難以判斷。盡管大量的細胞積累花青素后,可以用肉眼觀察 ,但是統計轉化細胞數目需要一臺低倍立體顯微鏡。小麥品種 Cadenza 還在發育的糊粉層細胞,瞬時表達轉化小麥 8S 球蛋白啟動子控制的玉米 C1 和 R-Lc 基因。只有這兩種載體 DNA 按相同摩爾數混合并通過基因槍轉化,才能看到花青素積累。培養 3 天后,利用萊卡 MZ8 型立體顯微鏡拍攝,該顯微鏡配備萊卡 DFC300FX 型數碼相機。

    2. 通過吸收光譜對植物提取物花青素進行定量

    通過組織提取、535 nm [ 56 ] 處光吸收值等方法,或者通過圖像分析來對花青素定量 [57]。可以通過高效液相色譜(HPLC ) 對各種花青素進行定量分析和種類鑒定,或者通過蒸發,將相同的植物提取物濃縮,利用液相色譜質譜(mass  spectrometry ) 聯用(LC- MS) 技術進行鑒定 [58]。

    (1)  取 200 mg 樣品于 3 ml 酸性乙醇或甲醇中(乙醇與 0.1 mol/L 的 HCl 的體積比為 85 : 15,pH 1.0),勻漿組織。

    (2)  用 4 mol/L 的 HCl 調 pH 至 1.0,用力振蕩 30 min。根據需要,重新調 pH 至 1.0。

    (3) 重新振蕩 30 min,27000 g,5℃ 離心 15 min。

    (4)  將提取物置于 5℃,48 h,27000 g,5℃ 離心 15 min,然后用 0.45 &mu;m 濾膜過濾。

    (5) 加酸性乙醇至體積為 3 ml。

    (6) 用溶劑設置空白對照,測量 535 nm 處的吸光值,計算花青素總含量。購買合適的標準花青素如花青素-3-O- 葡萄糖苷,繪制標準曲線;參照曲線,對樣品中的花青素含量進行定量。

    3. 通過成像分析定量花青素

    可以通過成像分析,測量色素強度,從而對花青素進行定量。

    (1) 取 1 ul 溶于酸性乙醇的已知濃度的系列花青素-3-O-葡萄糖苷(0~400 ug/ml)于載玻片上,用數碼相機采集圖像色彩強度和色素與花青素-3-O-葡萄糖苷之間的相關系數通過合適的軟件進行處理。

    (2) 參照上述操作,在相同條件下采集樣品圖像。

    展


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