擬南芥的轉化

實驗概要

本實驗采用花浸泡法利用農桿菌介導將目的基因轉入擬南芥。

主要試劑

YEB液體培養基，LB培養基，0.1 M CaCl₂，0.05 M MgSO₄，花浸泡緩沖液(0.5XMS，5%蔗糖，0. 03%Silwet L-77 )，Rif，Kan

主要設備

搖床，離心機，培養缽，溫室，托盤，塑料薄膜

實驗材料

已構建好的表達載體，擬南芥

實驗步驟

1. 農桿菌感受態細胞的制備和轉化

   1) 挑取GV1301單菌落于10 ml YEB或者LB液體培養基中，28℃振蕩培養至對數晚期；

   2) 取0.5 ml菌液加入50 ml新鮮YEB或者LB液體培養基中，28℃振蕩培養至OD600=0.5；

   3) 轉移至50 ml離心管中，冰浴20 min；

   4) 轉移至50 ml離心管中，冰浴20 min；

   5) 4℃，4000 rpm離心10 min，收集菌體；

   6) 沉淀用8 ml預冷的0.1 M CaCl₂和0.05 M MgSO₄重懸；

   7) 4℃，4000 rpm離心10 min，收集菌體；

   8) 取200 ul感受態細胞，加入0.5 ug質粒，輕輕混勻；

   9) 液氮冷凍50 s，冰上放置40 min，42℃熱激90 s；

   10) 加入800 ul LB培養基，28℃恢復培養1 hr；

   11) 涂布適量的細胞于篩選培養基上，超凈臺吹干表層液體；

   12) 28℃培養兩天。

2. 花浸泡法轉化擬南芥

   1) 接種含有表達載體的農桿菌克隆于5ml YEB培養基(含100 ug/ml Rif，100 ug /ml Kan)中，28℃，200 rpm，振蕩培養過夜；

   2) 按1：50的比例轉接到200 ml YEB培養基中28℃，200 rpm培養5 hr；5000 X g，離心15 min，收集菌體；重懸于花浸泡緩沖液(0.5XMS，5%蔗糖，0. 03%Silwet L-77 )，調OD₆₀₀至0. 8。

   3) 將擬南芥培養缽倒置于裝有花浸泡緩沖液的合適大小的容器上，浸泡3-5min，取出培養缽倒置于托盤中，用塑料薄膜覆蓋托盤，24 hr后取下薄膜，于溫室中繼續培養。