捕集離子淌度質譜帶來磷酸化蛋白質組研究新的深度

　　Yasushi Ishihama 教授

　　京都大學分子與細胞生物分析實驗室

　　2021年1月發表于www.ddw-online.com

　　目前，在蛋白質生物化學和蛋白質組學相關研究中，質譜（MS）已廣泛應用于鑒定和表征蛋白質。且隨著技術的不斷發展，質譜已經實現了更高的覆蓋深度、更快的分析速度和更高的靈敏度。例如，串聯質譜（MS/MS）是一種靈敏、準確、有效的檢測手段，通過產生并檢測序列特異性碎片離子¹對肽段進行解析。同時，相較于傳統的PTMs分析方法，如埃德曼降解法、氨基酸分析法、同位素標記法、免疫化學法等，存在如氨基酸序列覆蓋不完整，對不同PTMs的串擾、選擇性及其對細胞調控網絡的影響等諸多問題。串聯質譜也可作為解析蛋白質翻譯后修飾（PTMs）的有效工具，用于闡明控制細胞活動的復雜過程，如細胞分裂、生長和分化。

　　在可逆PTM中，蛋白質磷酸化為最主要的形式之一，用以調節細胞重要的代謝、激素、發育和應激反應，因此，在細胞的蛋白質合成、細胞分裂、信號轉導、細胞生長、發育和衰老²過程中，起著至關重要的作用。磷酸化水平異常會導致如癌癥和糖尿病等一系列疾病，因此，磷酸化蛋白質組學成為了探索健康和疾病密碼的重要工具。在細胞信號轉導網絡中，可逆磷酸化是將信號轉導到細胞核以控制基因表達的其中一項關鍵因子。此前研究學者估計人體內約有30%的蛋白質被磷酸化，但京都大學分子和細胞生物分析實驗室的研究人員開發了一種高選擇性的磷酸肽富集方法，并將該方法應用于檢測細胞磷酸化，研究結果發現：人體內至少有70％的蛋白質被磷酸化，超出了原先的預估^3,4。

圖1：Swiss-prot中各種PTMs統計概覽（參考文獻：Khoury, G., Baliban, R. & Floudas, C. Proteome-wide post-translational modification statistics: frequency analysis and curation of the swiss-prot database. Sci Rep 1, 90 (2011)）

　　捕集離子淌度質譜已經成為磷酸化蛋白質組學研究最強大的工具

　　隨著技術的進步，人們逐漸在磷酸化蛋白質組學方法中使用質譜技術來研究蛋白質磷酸化。通過對蛋白質和PTM的深入表征和定量分析，人們發現，理解蛋白的信號傳導途徑和異常疾病狀態至關重要。高分辨質譜儀的發展和專為蛋白質磷酸化整體分析量身定制的磷酸化肽富集技術，為分子和細胞生物學家研究蛋白信號轉導途徑提供了強大的工具。盡管人們已經取得了一些進展，但與未修飾的肽段檢測相比，識別PTM仍是一項挑戰。由于PTM蛋白通常以低豐度形式出現，并且不同蛋白質磷酸化的差異極大（跨多個數量級），由此推動了人們對更高靈敏度、更高峰容量檢測儀器的需求。

　　離子遷移譜（IMS）是一種氣相后電離分離方法，當與質譜結合使用時，可基于結構（離子構象）和質荷比（m/ z）對分析物進行快速、高分辨率的分離⁵。IMS-MS是一項完善的技術，在蛋白質分析方面已顯示出巨大的潛力，他可以提升多肽的鑒定質量，提供與LC-MS質量信息互補的結構信息。IMS-MS根據離子的形狀（IMS）和質量（MS）的差異來分離離子，從而傳遞離子的三維（3D）結構信息。這種通過構象差異分離離子的能力使得人們分離同分異構體成為可能，例如磷酸肽位置異構體（即肽段中磷酸化數目相同，但位點不同），而傳統質譜技術很難將它們區分⁶。

　　2017年，通過特定質量和遷移率的離子累積和聚焦的離子淌度技術，即捕集離子淌度（TIMS）技術被引入蛋白質組學，這使蛋白質分析的靈敏度和速度有了更進一步的革命性增長。TIMS能夠以毫秒為單位，在氣相中以高效、短循環周期和高分辨率特性對離子遷進行淌度分析，并且使用測量其碰撞截面積（CCS）⁷，并將CCS值用于蛋白質組學工作流程中，從而產生了由質量、強度、保留時間和CCS的4D-蛋白質組學方案。

　　TIMS通常與飛行時間質譜（TOF）結合使用，以達到更高的分析速度。結合平行累積連續碎裂（PASEF）技術，TIMS-QTOF MS系統可以提供更高速、更高靈敏度的檢測方法。新穎的設計使離子可以在系統前部淌度分析器進行離子的累積和聚焦，而后部淌度分析器則根據其離子遷移率，透過調控電場將離子依次釋放。TIMS與PASEF的強大結合可在少量樣品情況下，實現更大的磷酸化蛋白質組覆蓋率，并且通過使四級桿與TIMS，在特定肽段的洗脫時間內，提供>100Hz的測序速度而不損失靈敏度或分辨率。

圖2：捕集離子淌度用于磷酸化修飾位點區分

　　例如，京都大學的研究小組發現PASEF可以有效地提高串聯質譜的采集速率，從而達到磷酸化蛋白質組學研究新深度，提高鑒定結果的可靠性。PASEF采集模式的高速度和高靈敏度也有助于TIMS-QTOF MS實現高通量分析。這種優勢對宏蛋白質組學的相關研究極為重要，如分析大量樣品以在蛋白質組水平上研究人類和細菌之間的相互作用。下一步便是在現有的代謝蛋白質組學研究中利用PASEF的高速采集模式，找尋與疾病相關的潛在生物標志物⁸。

　　捕集離子淌度質譜用于激酶信號轉導研究

　　激酶信號是通過可逆酶促反應在底物上加上磷酸基團產生的，是細胞活動的重要組成部分，詳細研究激酶信號過程對于理解眾多疾病和開發新療法至關重要⁹。激酶介導的磷酸化信號通路是已知導致或驅動如癌癥等疾病發展的重要因素。京都大學的研究小組已經開發了磷酸化蛋白質組學方法，對激酶靶向藥物的體內磷酸化蛋白質組分析，其目的是促進癌癥治療藥物的發現和開發，進而探索、分析磷酸化分子的功能。因此，TIMS-QTOF-MS在藥物發現中，特別是在與癌癥相關的磷酸化方面具有重要意義。目前，人們已經開發出許多抑制特定激酶的藥物。迄今為止，已有超過19000種針對約260種蛋白激酶的激酶抑制劑被報道¹⁰，約30種小分子激酶抑制劑已被美國食品和藥物管理局（FDA）批準用于臨床¹¹。

　　京都大學的研究小組通過使用timsTOF Pro（布魯克）實現1分鐘梯度洗脫，并將其用于研究激酶抑制劑的作用機制（圖3）。這項工作希望通過實驗和計算，將激酶與其底物相結合，以揭示整個信號網絡。

圖3：帶有timsTOF Pro的毛細管LC 1分鐘梯度，100 s/run，864 run/d TIC =總離子色譜圖；XIC =提取離子色譜圖。

　　在過去的20年里，基于質譜的磷酸化蛋白研究已被應用于許多大規模分析細胞信號轉導的研究中。現在，基于LC-MS/MS^12,13上進行的激酶組研究，研究人員現在正在達到只有使用TIMS-QTOF MS才能達到的通量水平。

　　持續的技術創新推進蛋白質組學研究

　　顯然，基于質譜的蛋白質組學研究的發展（如使用TIMS技術的4D-蛋白質組學），已經讓研究人員在高通量、高靈敏度條件下深入了解分子和細胞功能。特別是使用PASEF采集法提供的超快分析速度和超高靈敏度，在低樣本量條件下就能達到鳥槍蛋白質組學和磷酸蛋白質組學研究新深度。這種4D-蛋白質組學方法將使科學家能夠在常規情況下探索以前無法獲得的蛋白質信息。

　　各種計算蛋白質組學的方法推動了蛋白質組學的未來發展，數據非依賴型采集（DIA）方法是基于質譜技術的磷酸化蛋白質組學的重要進展。DIA是近來較新開發的一種質譜采集技術，相比于數據依賴型采集（DDA），DIA以連續、無偏的方式對特定質量范圍內的所有前體離子進行MS2掃描。二代測序（NGS）技術與蛋白質組學的結合，在蛋白質基因組學等多組學領域，尤其是腫瘤臨床研究中得到了廣泛應用¹⁴。

　　通過將DIA與PASEF相結合，研究人員可以通過TIMS和m/Z雙重隔離模式來彌補傳統的DIA缺陷（圖4）。在dia-PASEF方法中可以大大增加離子利用百分比（對于低復雜度樣品能達到100%，對于高復雜度的樣品，仍然比使用類似隔離模式大小和m/z范圍的傳統DIA方法高5倍）。這可以縮短dia-PASEF采集的循環時間，使其與短梯度分離兼容，又能保持高選擇性。受益于TIMS空間聚焦效應，dia-PASEF不僅提高了檢測靈敏度，在全面4D-蛋白質組學支持下，可以將DIA選擇性提高到一個新水平。

圖4：dia-PASEF窗口分配示例。使用25Da寬的64個窗口，1.7秒循環時間dia-PASEF方法。此方法使用6.25％的離子，等效的3D DIA方案僅使用1.25％。

　　在過去的二十年中，質譜技術和新方法（例如TIMS，PASEF和dia-PASEF）已取得了重大進展，并將磷酸化蛋白質組學轉變為蛋白質研究者、生物學家和臨床研究人員尋求對蛋白質和細胞信號的更深入了解，并將其轉化為疾病轉化模型的強大工具。

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