提高效率的方法轉換從HPLC到UHPLC

從HPLC到UHPLC的方法轉換來提高實驗室工作效率，在科學研究和質量控制過程中常常要在HPLC高效液相色譜和UHPLC超高效液相色譜兩種檢測分析方法之間進行轉換。現代化的HPLC高效液相色譜儀和它的控制軟件支持用戶將這種方法移植到其他系統中使用，接下來就和小析姐一起學習一下吧。

在制藥和食品工業以及其他不同工業領域中，HPLC高效液相色譜檢測分析技術被廣泛用于目標化合物或者雜質的定性、定量分析。近幾年來由于檢測效率和檢驗分析能力的原因，UHPLC超高效液相色譜檢測分析技術已經進入實驗室的日常工作中來了。

這兩種技術的區別在于系統最大壓力的不同。由于UHPLC超高效液相色譜檢測分析技術有著很高的壓力穩定性,因此它可以在更短的時間內完成類似于高效液相色譜分析的任務。這種高端儀器設備主要是在科研領域中使用，以便能夠盡快的設計出新的檢驗分析方法。在臨床檢驗分析中也用到了UHPLC超高效液相色譜分析技術，以便通過快速的檢測分析來提高檢驗效率、提高儀器設備的利用率。

然而在許多常規分析中仍然使用普通的HPLC高效液相色譜儀，這主要是因為它在質量監控和質量保證中非常堅固耐用、維護保養費用低廉。在有著上述兩種液相色譜系統的實驗室中，一方面是將HPLC高效液相色譜法的檢驗操作方法移植到UHPLC超高效液相色譜法中，旨在增加檢驗分析時的通量;另一方面又將專門為UHPLC超高效液相色譜法研制開發的、更加穩健的操作方法移植到HPLC高效液相色譜法中。

然而，不同系統之間的方法轉換不僅僅只是縮短了檢驗分析的時間，而且還有許多參數是方法轉換過程中需要修改，例如：流速、時間程序和色譜柱尺寸等，在HPLC與UHPLC之間的方法轉換中這些參數都必須修改。另外，當您使用的色譜儀是不同生產廠家的產品時，這些參數也必須重新修改，不能一成不變的照搬。如果方法轉換不成功，則會出現不同的洗脫結果、不同的檢出率和不同的相對保留時間 – 簡而言之：檢驗分析的結果沒有可比性(參見圖1)。到底哪些參數是方法轉換時必須考慮的參數呢?

圖1以頭孢菌素類抗生素為例，從HPLC簡簡單單的轉換到UHPLC時存在的問題。

色譜柱尺寸和檢驗分析條件

從HPLC轉換到UHPLC最明顯的變化是色譜柱的不同。超高效液相色譜儀的色譜柱較短、內徑較細、粒徑較小，但這還不是全部不同之處，在調整了色譜柱的規格尺寸之后還要調整檢測分析的分離條件。適合于HPLC高效液相色譜法的最佳參數不能全部適用于UHPLC超高效液相色譜法，同樣適合于UHPLC超高效液相色譜法的最佳參數也并不能全部適用于HPLC高效液相色譜法。

在兩種色譜系統之間的方法轉換時首先要注意下列參數：

?流速;

?時間程序(梯度、閥和事件的切換等等);

?系統的死區容積;

?探測器的數據采集速率;

?注射量;

?系統的最大壓力。

重新編寫時間程序是必不可少的工作之一，尤其是在梯度分析中。只是縮短分析時間而不對梯度的時間程序做相應的調整會明顯的改變分離效果。在規定的分離條件下，相對保留時間和洗脫順序常常是規定好的，因此為了成功的實現方法轉換就必須調整時間程序。

兩種色譜法之間所有相關參數的調整匹配用手動方式轉換，是一件非常費時費力的復雜事情。為了避免這些麻煩、減少困難，一些液相色譜系統的供應商提供了成功實現方法轉換的參數換算程序、甚至(U)HPLC超高效-高效液相色譜系統專用的轉換方法。

可靠的雙向方法轉換

Shimadzu公司研發生產的Nexera-i MT方法轉換系統與Labsolutions軟件相互結合，是一種特殊的超高效-高效液相色譜法的轉換系統，其配用的軟件是在HPLC和UHPLC兩種系統之間雙向的計算轉移條件的軟件。它有兩條獨立的流路，一條應用于HPLC高效液相色譜儀連接，另一條用于與超高效液相色譜儀連接，因此可以實現無縫互換。

將HPLC與UHPLC在一個單元中組合起來帶來了許多好處。首先是可以在一個系統中成功的實現方法轉換，只需要驗證一個色譜設備就可以了。這當然也減少了實驗室的空間占用、減少了儀器設備的維護保養需求。另外，這一系統可以使用不同的實驗套件來調整系統的容積，這就大大的方便了不同生產廠家色譜儀之間的方法轉換了。

利用Labsolutions軟件附帶的方法參數的換算程序和方法轉換工具(參見圖2)可以方便的實現新、舊(U)HPLC系統的轉換。在新舊系統之間的轉換時，只要打開現用HPLC或者UHPLC方法的窗口，輸入新、舊色譜柱的規格尺寸、所需的最終流速就可以了。軟件會自動的計算出其他所有參數，計算的結果可以直接作為新方法保存下來，無需人工手動一個個輸入參數。

　　圖2 Labsolutions軟件中的方法轉換工具

方法轉換的實例

?頭孢菌類抗生素的快速分析：頭孢菌素是口服或者注射劑量的β-內酰胺類抗生素，在本例中，首先用HPLC高效液相色譜法對11種頭孢菌素進行了分離，然后在方法轉換工具的幫助下測定UHPLC超高效液相色譜分離中的最佳參數。圖3將色譜圖和它們使用的分離方法一同表示出來了。通過HPLC到UHPLC的方法轉換，在相同的洗脫模式下分離時間縮短了三倍。在HPLC每分析一次，分離需要的時間為65分鐘，而在UHPLC分離則可以在17分鐘內得到相同的分離結果。

　　圖3以頭孢菌素分離為例，從HPLC轉換到UHPLC的最佳轉換

?常規應用磺胺類藥物分析：磺胺類藥物是一組合成抗菌素，用于治療感染和化療等其他疾病。本例是將UHPLC方法轉換到常規的HPLC方法中去。根據新的色譜柱尺寸，利用方法轉換工具將九種磺胺類藥物的UHPLC方法轉換成在HPLC高效液相色譜法中使用的分離方法。各自的色譜圖和分析分離條件如圖4所示。轉換到粒徑較大、尺寸較長的色譜柱后，分離時間也從超高效分離時的5分鐘延長到了大約20分鐘，但分離效果幾乎是一樣的。

　　圖4以磺胺類藥物分析為例從UHPLC轉換到HPLC的最佳轉換

方法轉換的原因是多方面的：轉換到UHPLC超高效液相色譜法是會縮短檢測分析的時間，轉換到HPLC高效液相色譜法時確保了常規分析的穩定性。手工調整檢測分析參數的方法是費時費力的，而且相當復雜。利用軟件工具將現有的方法轉換的到新的(U)HPLC系統中去是現在最安全的、易于用戶使用的，而且也是最省時省力的替代方案。利用特殊的組合系統，例如將兩個單獨的UHPLC系統與和HPLC系統用Nexera-i MT組合在一起就不需要再對兩套系統獨立驗證了，而且這一方法還可以方便地在HPLC系統和UHPLC系統之間進行雙向切換。