(1)純化
不論使用何種制備方法,要獲得合格的標記化合物,都必須將反應物經過仔細的分離、純化。另外,一些標記化合物,經過一定時間的存放后,可發生脫碘和自身輻射造成蛋白質被破壞形成碎片,會出現不純物,故需對標記物重新純化。125I標記反應后的混合液需進行分離純化以除去游離 I 和其他試劑,純化標記物的方法有凝膠過濾法、離子交換色譜法、聚丙烯酰胺凝膠電泳法以及高效液相色譜法。
以葡聚糖凝膠(如Sephadex G-50)柱色譜分離純化125I標記物為例:標記反應混合液經柱色譜時,需定時或定量逐管收集色譜洗脫液,并用γ計數儀測定每管的放射性強度。通常最先洗脫出的為聚合物雜質放射峰,然后為含標記物的主放射峰,隨后即為游離125I-峰。
(2)鑒定
放射化學純度指單位標記物中,結合于被標記物上的放射性占總放射性的百分率,一般要求大于95%。I標記化合物的主要質量指標有以下四項:標記化合物的放射性比活度、放射化學純度、免疫活性、穩定性。
放射性比活性(specific radioactivity),是指單位化學量標記物中所含的放射性強度,也可理解為每分子被標記物平均所結合放射性原子數目,常用 a/g、mCi/mg 或 Ci/mmol 等單位表示。標記物放射性比活性較高時,可提高方法的靈敏度(相同放射性強度時,放射性比活性高者標記物用量少);但放射性比活性過高時,輻射自損傷大,標記物的免疫活性量易受影響,且貯存穩定性差。
依據標記反應中放射性核素的利用率(標記率)來計算:標記率=(標記抗原的總放射性/投入的總放射性)×100%=(投入的總放射性×標記率)/標記抗原量。該法計算操作簡便易行,但影響因素多,結果欠精準。
免疫活性(immunoreactivity),反映標記過程中被標記物免疫活性的受損情況。方法是用少量的標記物與過量的抗體反應,然后測定與抗體結合部分(沉淀物,B)的放射性,并計算與加入標記物總放射性(T)的百分比(B/T,%),此值應大于80%,該值大,表示抗原損傷少。