放射免疫測定法檢測抗生素殘留

1、基本概念和原理 

由 Berson 和 Yalow(1959)提出的應用同位素標記技術來檢測抗原抗體的高靈敏度方法,稱為放射免疫測定法。實際上,RIA 測定就是應用放射性物質代替 EILSA 中的標記酶作為抗體的偶聯物,在食品安全快速檢測中最常見的同位素是3H和14C。1978年 Charm 氏在 RIA 技術的基礎上發展了放射免疫受體檢測技術(RRA)。

RRA 在檢測食品中抗生素殘留的原理主要是基于以下兩個方面,其一,每類抗生素族均是在一個母環基礎上用不同功能團修飾形成特定功效的抗生素,例如:青霉素類是在內酰胺母環上加上不同功能團,形成了阿莫西林、氨芐青霉素、青霉素 G,其中青霉素 G 是最基本的青霉素。其二,微生物細胞表面都存在著能與各種抗生素功能基團結合的特異受點(這種高度的專一性類似于抗原和抗體間的專一性)。抗生素抑制細菌生長的能力是由微生物特定位上的附著決定的,并由此打斷該細菌的代謝活動。結合反應是在標記的靶參考物(示蹤物)與無標記的待測藥物(非標記物)之間競爭進行的。測試建立在藥物的功能團和微生物細胞專一性受點的結合反應的基礎上。

在此方法中,將細胞上具有特異性受體點的細菌加到含有3H或14C標記藥物的牛奶或組織提取物中,這些加放射標記的藥物與樣品中所含的藥物殘留物競爭可利用的細胞受體部位,樣品經離心除去上清液,沉淀在β-閃爍液重新懸浮,用液體閃爍計數器來測量其放射性。樣品的放射性與判定點(controlling point)比較,判定點的值是采用6個誤差在±15%的平行加標樣品的均值。樣品的放射強度與樣品中殘留物的含量成反比。牛奶、血清、雞蛋、組織中的檢測限在低于10-6范圍內,CharmⅡ檢測現已發展到可檢出內酰胺類、大環內酯類、四環素類、氯霉素類、氨基糖苷類和磺胺類這六大常見抗生素殘留的快速檢測。

2、應用舉例——CharmⅡ測試 

在現有的放射性檢疫檢測方法中作為快速檢測方面最成功的例子是 CharmⅡ6600/7600抗生素快速檢測系統,該檢測系統就是利用專一性受體來識別結合同一類抗生素族中的母環以便以最快的速度同時檢測同一抗生素族在樣品中的殘留情況。它可以檢測動物和魚類的肌肉組織、蛋類、飼料、蜂蜜、水、水果、蔬菜、谷物等樣品。目前 CharmⅡ7600檢測系統就 β-內酰胺類、氯霉素類、四環素類、磺胺類、鄰氯青霉素及堿性磷酸酶這六項檢測已被 FDA 認可。現以牛奶中 CharmⅡ β-內酰胺測試競爭性檢測為例,對其工作原理、操作方法等方面詳述如下。

①原理 CharmⅡ7600/6600型 β-內酰胺實驗使用一種具有吸附所有 β-內酰胺藥物的特殊受體的細菌,這種細菌隨同一種被14C標記的特定量青霉素 G一起加入牛奶樣品。牛奶樣品中的任何一種內酰胺均會和這種特殊標記的青霉素 G 競爭性地與細菌細胞上的特異性受體結合。

把吸附于受體位點上的14C 青霉素 G 的數量和預先測定的控制點或標準曲線進行比較。14C-青霉素 G 的量越大,則樣品中 β-內酰胺的濃度則越低(也即 cpm 數值越大,則樣品中 β-內酰胺濃度越低)。Charm Ⅱ檢測推薦的抗生素殘留篩選水平見下表。

②操作步驟

a.把綠色藥片(即細菌載體)加入空試管中。

b.加入300μL±100μL水。混合10s 至藥片溶解,必要時可延長時間以確保藥片的溶解。

c.加入5.00mL±0.25mL 樣品或標準物(青霉素 G)。(注:每一個樣本使用一個新試管吸頭。牛奶溫度0～7℃。)

d.加入黃色藥片(被14C 標記的青霉素 G),在15s 內通過上下旋轉牛奶15次使其立刻混合。(注:加藥片及混合所有樣本必須在40s 內完成。)

e.在85℃±2℃的恒溫箱中保存3min。

f.離心3min,立刻從離心機中取出并倒掉牛奶。(注:如果必要,用棉拭擦去脂肪環,保持試管倒置。)

g.用棉拭擦去脂肪環并使其干燥。注意不用破壞藥劑。

h.加入300μL±100μL水,徹底混合至藥劑溶解(在添加閃爍液之前藥片必須是浮在水中)。

i.加入3.0mL±0.5mL閃爍液,加蓋,倒置(或搖動)直至混合物形成均勻的渾濁液。

j.在分析儀中進行60s 計數。在14C 頻道讀出每分鐘計數。

③解釋結果  基準點是介于陰性結果和陽性結果之間的一個截斷數字。

如果樣品每分鐘計數是大于基準點,則樣品為陰性。

如果樣品每分鐘計數是小于或等于基準點,則樣品是“假設陽性”,應該再測試(見假設陽性檢測)。

如果樣品結果位于基準點以上不足50 cpm,則需重新計數這一測試管。如果每分鐘計數是大于基準點,樣品為“陰性”;如果每分鐘計數是小于或等于基準點,則樣品為“假設陽性”,那就必須再次測試(見假設陽性檢測)。

④基準點(對照點)  基準點的測定是使用0.0080IU/mL(4.5μg/kg)青霉素 G 作陽性控制標準,以建立一套數據值判別陽性或陰性。對每一種新型試劑建立一套基準點和零點控制均數。

a.操作3次零點控制標準以確定均數。這作為零點控制均數。

b.操作6次陽性控制標準以確定均數。

c.在陽性均數上加15%則為基準點。如果所有6次測定都在陽性均數的15%以內,則基準點有效。對于單個偏差,則重做基準點測試。

⑤假設陽性試驗  “假設陽性”樣品的檢測要備成雙份以同時和一份陽性控制標準和一份零點控制標準配對用于陽性和陰性控制標準的試劑瓶必須和用于基準點測定的瓶子分開。

a.零點控制標準必須在零點控制均數±20%以內。

b.陽性控制標準必須小于基準點。

c.如果條件滿足而且測樣品的任何一個小于或等于基準點,則樣品是“β-內酰胺篩選陽性試驗”。如果需要,陽性樣品可定量測定。

⑥操作監控  每天測試樣品前測一個零點控制和一個陽性控制標準,以確定儀器和試劑的正常。