數字PCR助力新型冠狀病毒藥物臨床試驗及治療監測

　　2019新型冠狀病毒，即“2019-nCoV”，2020年1月12日被世界衛生組織命名。冠狀病毒是一個大型病毒家族，其中SARS-CoV、MERS-CoV和2019-nCoV均屬于β屬冠狀病毒。

　　截止最新的確診病例信息顯示，新型冠狀病毒的傳播能力比SARS更強，導致疫情傳播速度較快，給疾病防控工作帶來極大的挑戰。新冠肺炎診療方案（第五版）指出，呼吸道等標本熒光PCR檢測新冠病毒核酸陽性是確診方式之一。從感染到治愈，至少需3次使用PCR檢測：疑似篩查、確診、治愈出院。而受限于熒光PCR的檢測能力，出現了多例假陰性，導致耽誤確診及治療。針對2019-nCoV病毒的監測相關技術已成為應對疫情的緊急重點研究方向。其中面臨最大的問題就是建立高靈敏度且定量的復核和鑒別診斷技術體系。

　　數字PCR的絕對定量能力正好可以滿足這一需求。數字PCR也被稱為第三代PCR技術，是一種核酸分子絕對定量技術，其核心思路是將模板分子稀釋并平均分配到無數個獨立反應腔室中，進行PCR擴增，通過PCR終點信號“有或無”來實現不依賴于標準曲線和參照樣本的單分子絕對定量。現有的數字PCR主要以微孔或微液滴作為獨立反應腔室，以微液滴數字PCR為例，其工作流程如圖1所示。

圖1 新羿微液滴數字PCR工作流程

　　相比于熒光PCR技術（第二代），數字PCR具有諸多優勢，主要體現在以下幾個方面：

　　·數字PCR的定量結果更為可靠。數字PCR是反應單元內的單拷貝核酸擴增，其定量依賴于陽性反應單元的數量（整數，呈離散分布），而非熒光強度（實數，呈連續分布）。

　　·數字PCR的定量結果更為直觀和準確。熒光定量PCR（qPCR）的結果展示方式為擴增曲線，一般需要使用最大二階導數的位置確定△Ct值，模板的△Ct值與參比的△Ct值之差僅能半定量地表示模板相對于參比的倍數關系，很難做到精確的絕對定量。而數字PCR則采用區分明顯的“陰性”和“陽性”反應單元的數量來進行定量，其計數具有很高的直觀性準確性。

　　·數字PCR善于在大量背景模板的干擾下對罕見的目標模板進行檢測。由于背景模板被大量的反應單元所分割和稀釋，在含有罕見目標模板的反應單元中，背景模板的數量被呈數量級地減少了（比如將PCR體系分割為10000個反應單元，則每個反應單元內的背景模板的數量被減少4個數量級），因此PCR擴增時目標模板受到的非特異性干擾也呈數量級地減少，從而保證這些罕見的目標模板的有效擴增。

　　·數字PCR對抑制劑的抗性大大增強。類似于上述討論，由于抑制劑的分子數量被大量的反應單元所分割和稀釋，在含有模板的反應單元中，抑制劑的分子數量被呈數量級地減少了，因此PCR擴增時目標模板受到的抑制劑的干擾也呈數量級地減少，從而保證模板的有效擴增。

　　綜上所述，數字PCR技術相比于前兩代PCR技術，是一項可靠、精準和直觀的核酸擴增和檢測方法，尤其適用于復雜樣本中目標核酸拷貝數的定量。在新型冠狀病毒的檢測中將發揮如下重要作用：

　　① 用于有接觸史尚無癥狀者排查：基于數字PCR的高靈敏度，檢測病毒攜帶狀況；

　　② 用于新型冠狀病毒疑似患者診斷復核：基于數字PCR的高靈敏度和高準確性，可用于熒光PCR的Ct值在37-40之間的可疑樣本判定。

　　③ 用于新型冠狀病毒感染患者病毒載量動態觀察：基于數字PCR的絕對定量能力，無需依賴標準物質即可可為臨床醫生提供更為準確的病原體載量信息，協助判斷病情并及時調整治療策略。

　　④ 可用于治療后患者體內病毒轉陰的復核，用于指導出院。

　　⑤ 標準參考物質的制備：數字PCR是制備標準參考物質定量的重要方法，為熒光PCR試劑盒提供可靠的標準物質。

　　《中華醫學雜志》2020年2月11日刊登的《新型冠狀病毒肺炎病毒核酸檢測專家共識》中指出，及時對急重癥及疑似患者進行診斷需要快速有效的方法，病毒核酸檢測可為診斷提供直接證據。當qPCR檢測判讀為“可疑”結果時，實驗室應考慮“更換不同廠家的試劑盒重復實驗或采用敏感度更高的方法，如數字PCR方法進一步確定”。

　　新羿TD-1 數字PCR系統：

　　新羿TD-1數字PCR系統由Drop Maker 樣本制備儀和 Chip Reader 生物芯片分析儀及其他相關試劑耗材構成。

　　產品優勢：

　　◇ 超敏：靈敏度低至0.01%；

　　◇ 便捷：操作簡單，無須手動移液；

　　◇ 可靠：多重防污染，避免假陽性；

　　◇ 開放：支持個性化檢測項目開發。

　　產品資質：

　　公司在中國疾病預防控制中心指南的指導下，開發了基于數字PCR的創新一步法2019-nCoV核酸檢測試劑盒。

新羿生物新型冠狀病毒 2019-nCoV 核酸定量檢測試劑盒

　　產品優勢：

　　◇ 靈敏度高：最低檢測下限 100copies/mL；

　　◇ 定量準確：無需標準品和標準曲線；

　　◇ 快速檢測：2小時即可完成核酸樣本檢測；

　　◇ 操作簡便：一步上樣，操作簡單，微液滴生成后無需轉移，人為誤差小；

　　◇ 封閉檢測：全封閉體系檢測，防止氣溶膠污染和樣品損失，預防假陽性；

　　◇ 特異性好：與其他常見呼吸道病原體（病毒、細菌、真菌）無交叉反應。

　　樣本類型：

　　◇ 上呼吸道標本：包括咽拭子、鼻拭子、鼻咽抽取物、深咳痰液；

　　◇ 下呼吸道標本：包括呼吸道抽取物、支氣管灌洗液、肺泡灌洗液、肺組織活檢標本；

　　◇ 其他：血液標本、血清標本、組織培養物等。

　　該試劑盒目前在北京協和醫院、軍科院、北京地壇醫院、浙江大學第一附屬醫院等重點醫院、重點實驗室已完成近500例臨床驗證，性能優異。

　　本產品已于2020年2月3日入選中關村首批抗擊疫情新技術新產品新服務清單。

　　訂購信息：

　　本項目面向臨床實際需求，在當下疫情中具有重要的臨床應用前景，為疫情的防控提供優秀的解決方案。新羿生物與奮戰在疫情前線的醫護英雄們一起，攜手共渡難關！