概述
2015年剛成歷史，2016年已在眼前。就這樣，年復一年間滄海成桑田。生命科學領域，新方法層出不窮，老方法不斷升級，好不熱鬧。也如孔子的感嘆：逝者如斯夫，不舍晝夜。
就拿PCR技術來說，熒光定量PCR作為一種進行基因表達分析的技術，截至目前最大的應用市場是病原微生物的核酸體外診斷。展望未來，作為qPCR升級版的數字PCR，最大的應用市場必然將轉變成腫瘤相關的液態活檢，對此陳斯卡堅信不疑。
那么，數字PCR在病原微生物的核酸體外診斷方面，是否仍然存在機會？是否在某些方面具有更出色的表現？對于《Lennette's Laboratory Diagnosis of Viral Infections第四版》的編輯Keith R. Jerome而言，答案是肯定的。2013年1月他就撰文，顯然看好數字PCR在病毒檢測中的應用前景，但2013年年初時，來自學術界一線的數據還較少，所以那篇綜述可以理解為僅僅是他個人的看好。
一年后，在學術界源源不斷的數據產出下，Keith R. Jerome（他任職于Fred Hutchinson Cancer Research Center的疫苗和傳染病研究部門）結合自己的研究數據，于2014年5月撰文論述了數字PCR在病毒臨床檢測上的應用前景。本期，我們以他的觀點為代表，闡述數字PCR在病原微生物（不僅限于病毒）核酸分析中的優勢及應用的可能性。
qPCR面臨的問題
雖然熒光定量PCR是目前病毒分子檢測方面的“金標準”，具有廣泛的應用，但由于對核酸分子的定量是依賴Ct值進行計算得到的，因此qPCR的最大瓶頸在于需要依賴于標準曲線。而構成標準曲線的標準品本身又缺乏統一的計量標準，因為標準品本身就是已知濃度或含量的樣品。這兩方面的因素造成了qPCR定量的結果在實驗室內部與實驗室之間的偏差（intra-和inter-laboratory imprecision），甚至不同實驗室得到的結果是矛盾的。
數字PCR基于單分子層面的計數，可以徹底擺脫對標準品的依賴，解決由此而引起的結果重復性差的問題，大大提高檢測結果的精度。
dPCR在精度方面的優勢
對于qPCR而言，尤其當病毒處于低豐度水平的情況下，檢測結果的精度往往不理想。即使對于那些很有經驗的實驗室，有時結果的CV值（coefficient of variation）在20~30%之間，甚至更高。
截至目前，造成這種偏差的原因不明，對于CMV（巨細胞病毒）和HIV的研究表明，病毒載量的微小上升在臨床上也具有顯著意義。Waggoner對22例CMV感染患者的檢測顯示，病毒水平從200 copies/ml以下增加到200 copies/ml以上，患者就會出現明顯的癥狀。這種情況下，檢測結果的精度對于臨床治療尤其重要。精度越高，越能排除檢測技術本身導至的偏差，結果越能反應患者在不同的檢測時間（日或周）病毒水平的差異。如果病毒載量的對數差在50%以下， qPCR技術就不能實現有效區分。
由于數字PCR絕對定量的特點，在相同TaqMan檢測體系下，能顯著降低結果的CV值。例如，Strain對150例HIV感染患者pol基因和2-LTR環狀DNA的檢測表明，pol基因ddPCR結果的CV值比qPCR下降了4倍，2-LTR環狀DNA ddPCR結果的CV值下降了20倍（ddPCR和qPCR對每個樣品進行3次平行檢測）。即使對高水平CMV（大于10,000）的對比實驗顯示，ddPCR結果的CV值也低于qPCR。本綜述作者所在實驗室對不同濃度CMV的測試也得到相同的結論。
ddPCR對結果精度的提升還體現在“比例測試”的檢測上，例如對以染色體重組整合方式存在的HHV-6（人類皰疹病毒6型）檢測。人群中約1%的HHV-6病毒通過與人染色體著絲粒區域重組的方式存在，這種情況下qPCR不能區分HHV-6急性感染和ciHHV-6潛伏感染。ddPCR采用雙重探針檢測，可分別檢測HHV-6的保守區域與宿主細胞的內參基因，最終通過HHV-6/cell的數值來判斷患者是否是ciHHV-6潛伏感染。對經FISH驗證的ciHHV-6感染患者淋巴細胞的檢測發現，上述比值的平均值為0.96，SD值為0.03，CV值僅為3%。
dPCR可助力分子檢測的標準化
qPCR進行病毒檢測其結果在實驗室之間可比性較差，究其原因在于“標準品”沒有統一的標準。世界衛生組織（WHO）專門制備了“標準品”供全球的實驗室使用，目前對“標準品”的定標采用對不同實驗室的結果取平均得到。最近National Institute for Standards and Technology采用數字PCR的方法對CMV（SRM 2366）進行定標（CMV也是第一個采用數字PCR來進行定標的病毒），由于對該標準品給出了絕對的拷貝數，所以能用于實驗室之間的校正、方法學的驗證、不同assay結果的比較等等。
dPCR對抑制劑更高的耐受度
本綜述作者專門設計了對比實驗，系統比較了ddPCR和傳統定量PCR對SDS、EDTA、Heparin（肝素，血液抗凝劑）等常見臨床樣品中PCR抑制物的耐受程度。通過比較兩種平臺的抑制曲線和最大抑制濃度中值（IC50）表明，ddPCR對SDS、肝素的耐受度高于熒光定量PCR。ddPCR的這一特性使得該技術尤其適合于復雜臨床樣品的檢測，如糞便、痰液和組織樣品等等。
為什么ddPCR能更加耐受PCR抑制劑的機制還處于進一步研究中，可能的原因有二：1，因為ddPCR在反應終點對熒光信號進行檢測，所以對PCR擴增效率的要求大大降低，而熒光定量PCR則要求assay的擴增效率必須在90~110%之間；2，ddPCR的微滴化過程將PCR抑制劑排除在PCR反應液的水相環境之外，從而提高了對抑制劑的耐受度。
原文閱讀
Tanis C. Dingle, Ruth Hall Sedlak, Linda Cook, Keith R. Jerome. Tolerance of Droplet-Digital PCR vs Real-Time Quantitative PCR to Inhibitory Substances. Clinical Chemistry 59:11 （2013）
dPCR目前存在的問題
數字PCR畢竟是一種比較新的技術，綜述作者認為5年內還不可能取代熒光定量PCR方法大規模用于臨床上對病毒的分子檢測。
目前來看相較于qPCR，數字PCR的通量及單個樣品檢測的成本還不具優勢。
數字PCR的自動化程度還不能和熒光定量PCR處于同一水平。
同樣的條件下，數字PCR檢測的線性范圍不及熒光定量PCR。
相比于熒光定量PCR，在檢測的靈敏度方面數字PCR并未表現出優勢。（關于這點，已有很多研究顯示出數字PCR在靈敏度上的優勢，后續會專門就這個問題進行介紹）
dPCR的兩種實現方式
目前已經面市的商業化數字PCR設備通過2種方式來實現：芯片式（以Life Technologies和Fluidigm為代表）和微滴式（以Bio-Rad和RainDance為代表）。從檢測成本看，目前Bio-Rad的ddPCR最低。此外，Bio-Rad也已經實現了最大96個樣品的自動化微滴制備和檢測。
dPCR定位之陳斯卡觀點
能夠實現復雜來源樣品中
極低含量核酸分子（DNA或RNA）
穩定檢出的一種基于PCR的
絕對定量技術