病原細菌產生耐藥性，能夠降低細菌感染后的藥物治療效果，并增加細菌感染和傳播的風險，是造成食品安全問題和健康威脅的重要因素。細菌耐藥性可分為固有耐藥（intrinsic resistance）和獲得性耐藥（acquired resistance）兩種。在獲得性耐藥中，攜帶耐藥基因的質粒可導至耐藥性在同種不同株、或不同種屬的細菌中快速傳播；因此，迫切需要研究者對抗生素耐藥性、尤其是質粒攜帶的耐藥基因進行監測、以及對耐藥機制進行研究。
確定菌株中重要耐藥基因是否由質粒攜帶、以及質粒復制型別，是評價菌株耐藥獲得和傳播風險的重要指標。針對此目的，目前主要應用基于抗生素耐藥基因的探針標記聯合Southern印跡、以及基因組測序技術，但這些方法流程復雜、耗時較長，且當探究耐藥基因在質粒上的共存情況時，需要獲得質粒完成圖，就必須采用二代+三代的基因組測序策略，成本高、耗時長、需要專業生物信息分析。
在中國疾病預防控制中心傳染病預防控制所團隊近日發表的文章中，建立了一種簡便、靈敏的質粒傳播耐藥基因及鑒定質粒復制子類型的檢測方法。研究中將沙門菌核酸經S1核酸酶處理后使用脈沖場凝膠電泳（PFGE）進行分離，回收質粒電泳條帶后作為微滴式數字PCR（ddPCR）的模板進行目的基因鑒定（稱為S1-PFGE-ddPCR方法），測定的質粒攜帶耐藥基因在回收質粒帶上的拷貝數明顯高于背景噪聲。這個方法原理是該回收質粒所攜帶的共存基因具有相同的ddPCR反應、及相同的拷貝數，并明顯區別于背景核酸模板（在PFGE電泳凝膠中，泳道凝膠內實際含有破碎的質粒和染色體核酸片段，形成背景“污染”，并可導至擴增信號，也因此使用ddPCR會使拷貝數比較鑒定更準確）。這些結果與質粒完成圖測序結果一致。與Southern印跡和完整質粒測序策略相比，S1-PFGE-ddPCR方法耗時更短，數據易于分析。因此，該方法為質粒攜帶的耐藥基因檢測提供了一種節省時間、更簡便的方法，有望成為檢測質粒攜帶的共存耐藥基因的有價值的工具。 圖1. S1-PFGE-ddPCR實驗流程 S1-PFGE可以分離回收得到純度較高的質粒核酸片段。 圖2. S1-PFGE顯示各菌株中的質粒 所獲得的質粒核酸即可作為模板、使用微滴式數字PCR（ddPCR）對目的基因進行鑒定。ddPCR是第三代的PCR技術，通過油包水微滴介質將核酸分子包被起來，在每個微滴中獨立進行PCR反應。這種方法可以對核酸拷貝數進行絕對定量，無需借助標準曲線也避免了標準曲線引入的誤差，也不受Ct值偏差的影響，所以ddPCR在準確性上優于實時熒光定量PCR（qPCR），利于區分背景信號，并且能一定程度下耐受PCR抑制劑對實驗的影響。 圖3. ddPCR實驗流程 使用本研究構建的方法進行了菌株測試，這些耐藥沙門菌攜帶含耐藥基因的質粒，用二代+三代基因組測序獲得了這些質粒的完成圖序列。共設計了針對6個靶基因位點的檢測引物探針，分別是3個耐藥基因（mcr-1、blaCTX-M-55和blaCTX-M-14）和3個質粒復制子基因（IncHI2、IncI2和IncX4）。使用qPCR優化實驗條件后直接用于ddPCR檢測。使用S1-PFGE-ddPCR方法鑒定質粒復制型及其攜帶耐藥基因、與質粒序列測定結果完全一致，表明S1-PFGE-ddPCR方法的準確性為100%。通過梯度稀釋實驗驗證，ddPCR的檢測限為2.02*10-6ng/μL，qPCR的檢測限為2.02*10-4ng/μL，對應34.6的Cq值，顯示ddPCR的檢測限比qPCR低兩個數量級，更加靈敏。 圖4. ddPCR與qPCR的梯度稀釋檢測結果對比 從時間流程看，S1-PFGE-ddPCR的耐藥質粒鑒定方案的耗時相比測序法短20小時以上，比Southern印跡法短30小時以上，節省了一天左右的實驗時間，而且無需進行待檢基因探針的標記、凝膠電泳后的核酸轉膜、探針雜交顯色等復雜步驟。
圖5. S1-PFGE-Southern印跡、S1-PFGE-ddPCR與質粒測序工作時間對比