Skyline 軟件
Skyline 軟件是華盛頓大學 MacCoss 教授實驗室開發的目標蛋白質組學分析軟件（https://skyline.gs.washington.edu），是 DIA/SWATH 數據處理的權威工具，由于功能全面、性能強大而受到普遍認可，是目前使用最廣泛的 DIA/SWATH 解析軟件。通過與Thermo Fisher Scientific 的緊密合作，MacCoss 教授實驗室有針對性地優化了 Skyline 對 Orbitrap 數據的處理，一步實現從原始數據到最終結果的完整 DIA 解析流程，使 Orbitrap DIA 如虎添翼。
以 Proteome Discoverer 軟件（或 MaxQuant、Mascot 等）搜庫鑒定結果為譜圖庫，導入 Skyline 軟件；設置肽段、離子對挑選規則；將符合條件的肽段及子離子從譜圖中挑選出來，生成 Target List；導入 DIA/msxDIA 數據，根據 Target List 提取離子對色譜峰，進行子離子匹配和峰面積計算，實現對肽段的同時定性和定量（圖 13）。若樣品中加入標準肽段，則可利用標準肽段進行保留時間校正。
圖 13. Skyline 處理 DIA 數據完整流程
圖 14. 使用 mProphet 進行統計學分析并卡值過濾
定性
使用 Skyline 內嵌的 mProphet 卡值工具對譜圖匹配結果進行統計學分析，綜合考慮 dotp 分數、信號響應、保留時間、質量偏差等因素計算 q 值，過濾結果，獲得高度可信的肽段定性結果（q < 0.01）（圖 14）。
定量
經定性卡值（q < 0.01）后，最終獲得所有可靠離子對的色譜峰面積和 CV 值，將結果以 Excel 表格式導出，使用 CV < 20% 的離子對峰面積進行定量分析，完成 DIA 分析工作（圖 15）。
圖 15. 獲得離子對峰面積、CV 值，計算定量結果
七、應用實例
該應用實例為采用 DIA 方法完成的大規模蛋白質組學及磷酸化蛋白質組學定量實驗。在 120 分鐘的有效梯度內，以 q < 0.01 和CV < 20% 為過濾條件，在 200 ng Hela 全細胞裂解液中同時定量 3597 個高可信度蛋白質（21710 肽段）；并在同樣的實驗條件下，同時定量了 11341 條高可信度的大鼠磷酸化肽段。實驗證實，無論是常規的定量蛋白質組學實驗還是翻譯后修飾定量研究，DIA 方法都具有無可比擬的定量性能。
八、文獻資料
