整裝培養細胞生物膜系統的標本制備及觀察實驗

腎上皮細胞

高錳酸鉀 秋水仙素 PBS Formvar液

顯微鏡 相差顯微鏡 透射電子顯微鏡 鎳網 載玻片 蓋玻片 培養皿 CO2培養箱

一、高錳酸鉀固定法顯示用藥（秋水仙素處理）前后CV-1細胞生物膜系統光鏡標本的制備及觀察。

1.  取無菌蓋玻片，分別放入二個直徑5 cm 的培養皿中，接種CV-1細胞，加3 ml 培養基。

2.  加蓋做好標記，移入CO₂培養箱培養24小時。其中一個培養皿在終止培養前4小時，加入10 ug/ml 秋水仙素0.3 ml。

3.  在倒置顯微鏡下觀察選定長有鋪展良好細胞的蓋玻片，終止培養，倒掉培養液。

4.  PBS液沖洗蓋玻片二次，清除細胞表面的培養基和雜質。

5.  取出蓋玻片，將長有鋪展良好細胞的蓋玻片，細胞面朝上放在載片上。

6.  滴新配制的高錳酸鉀固定劑于蓋玻片上，固定10分鐘。

7.  蒸餾水輕輕地沖洗標本的細胞面5次，去除殘留固定液。

8.  取下蓋玻片，用濾紙吸干多余水份，滴1滴PBS液于載玻片上，將蓋玻片附有細胞面朝下，裝片。

二、高錳酸鉀固定液顯示用藥（秋水仙素處理）前后CV-1細胞生物膜系統電鏡標本的制備及觀察。

1.  用0.5%Formvar液制做支持膜。

2.  將覆有Formvar膜的鎳網經紫外線燈滅菌后，放入直徑5 cm 的無菌培養皿中，加培養基3ml。

3.  接種CV-1細胞于鋪有支持膜的鎳網上，一組是不經藥物處理的作為對照組，另一組是經10 ug/ml 秋水仙素處理的作為實驗組。

4.  實驗組的培養細胞在終止培養前4小時加入10 ug/ml 秋水仙素0.3 ml，放入CO₂培養箱中進行細胞培養。

5.  待細胞鋪展開后，取出鎳網，用乳頭吸管滴1滴高錳酸鉀固定液于鎳網上，固定細胞10分鐘。

6.  經上升梯度乙醇系列脫水：30%→50%→70%→85%→90%→95%→100%，每次脫水3分鐘。

7.  待鎳網晾干后，在透射電子顯微鏡下（75 KV 電壓）進行觀察。

三、結果

1.  在光鏡下和透射電子顯微鏡下，內質網呈網狀鋪展于整個細胞質內。

2.  細胞核周圍的內質網形成較稠密三維結構，遠離細胞核周圍的內質網則呈松散的網狀伸展至細胞邊緣。

3.  在電鏡下可見內質網由細管和扁囊構成。除內質網外，還可看到粗大的呈條索狀的線粒體，也可觀察到高爾基器和溶酶體等膜性結構。

4.  CV-1細胞經秋水仙素處理后，其內質網向細胞核周圍聚集，細胞邊緣區域不再觀察到內質網。

5.  秋水仙素破壞微管結構，因此，內質網的分布可能與微管的存在有密切關系。