斑馬魚基因敲除是怎么做的？

一、基因敲除的設計方案

1.1 基因的基本信息
確認斑馬魚基因的基本信息，包括名稱ID號等，一般會在NCBI等查詢。
 
1.2 分析基因結構、氨基酸序列等做生物學信息的分析
 
1.3分析蛋白質的保守結構功能域
通過綜合考慮，設計最佳的KO靶點。
 
1.4 分析并設計CRISPR，分析其效率及脫靶的情況
一般使用CCTOP，少數物種如沒有可找其它專業網站。
 
二、CRISPR活性驗證

2.1 分析并確認基因組序列
設計Genotyping引物，確認實際基因組序列與理論匹配情況，如CRISPR靶點驗證與理論序列存在出入，需回到1.4重做。
該步驟還需要確認引物擴增條件，以備后用，如不能正常擴增需要重新設計，并且不能進行下一步操作。
 
2.2 合成sgRNA
使用Thermo轉錄試劑盒轉錄，完成后需測定濃度（不得低于400 ng/μl） 和OD值（260/280需在1.8~2.2）。
 
2.3 顯微注射
將上述合成好的sgRNA按照一定的比例與Cas9蛋白預混，使用顯微注射技術將其注入斑馬魚早起胚胎中。
 
2.4 活性驗證
隨機選取8~24 hpf的8枚注射后的胚胎通過PCR后將其產物送商業公司sanger測序，需要看到至少有一組在靶向位置存在Indel突變。

• 如有，挑取存在Indel突變的亞克隆確認；

• 如沒有，回到2.3或2.2或1.4（具體回到哪一步需要根據實際情況決定）

 
三、突變體制備及確認

3.1 F0飼養
如2.4驗證有活性，一般需要顯微注射400~500枚胚胎作為F0（一般由胚胎發育至成體有10~20%），至少需要40尾以上的F0。
 
3.2 F0可遺傳突變的確認
將上述F0親本與野生型雜交（或者自交），將所產胚胎隨機選取8枚經測序確認，如存在Indel突變，則該F0親本即為可遺傳突變體。以此方法至少鑒定出3尾可遺傳的F0。
 
3.3 F1飼養
將3.2至少3尾親本經交配，每組一般15~25尾，一般總量需到達40~50尾。
 
3.4 F1確認
將3.3的F1飼養至2~2.5月齡,獲得其尾鰭基因組，通過PCR后測序確認其具體基因型（要求必須是移碼突變或出現提前終止密碼子的突變）。
 
四、最終交付產品

至少獲得3尾以上移碼突變F1代斑馬魚（不限雌雄、不限具體突變類型），以及上述結項報告一份。
 
后續服務
一般客戶拿到3尾移碼突變斑馬魚并不能直接做實驗，還需要繼續擴繁、建系或做后研究等，因此我們也有后續服務。
 
五、突變體傳代

釋義：根據客戶具體要求，通過自交（或者雜交），將某一種（或者多種）突變型擴大種群（或保持種群。
根據客戶常規要求，我們一般提供30~40尾（雌雄各不少于8尾）經堯順禹鑒定后的確認為突變體的Fn+1代斑馬魚。
 
六、表型觀察及基因功能研究