自2019 年 12 月以來，湖北省武漢市陸續發現新型冠狀病毒（2019 novel coronavirus, 2019-nCoV）感染患者，且呈快速上升之勢。自新型冠狀病毒疫情爆發以來，近期湖北、武漢疫情從過去的爆發式增長已經走向趨緩，武漢防控工作取得階段性成效。
而事實上，在2020年1月初，當新型冠狀病毒尚未完全確認時，我科分子病原實驗室已發現常規病原體陽性率突然下降，并敏銳的察覺到可能出現了新的無法識別的病原體。科室在第一時間要求門診所有采樣人員做好防護，同時要求所有呼吸道樣本核酸提取人員嚴格進行三級防護。新型冠狀病毒疫情爆發后，2020年1月22日國家衛生健康委發布的《新型冠狀病毒感染的肺炎診療方案（試行第二版）》中將新型冠狀病毒核酸檢測列為確診標準。我科最早開始進行核酸檢測，并迅速擬定應對方案及人員調整，確保6小時內出結果，為臨床病患確診提供依據。
但在疫情早期，由于患病人數多，武漢地區能進行核酸檢測實驗室嚴重不足。我科經過周密部署并對照既往標準，在人員配置、設備安置、檢測試劑性能評價和生物安全防護等方面進行了合理化調整，從最初的常規核酸檢測流程迅速轉變到新型冠狀病毒核酸規范化檢測流程中。每天標本接收與滅活、試劑配制、核酸提取、PCR擴增、結果判讀、報告審核、數據整理、質量控制、生物安全、后勤保障等均設置專人負責。實驗室實行全天24小時4班輪換工作方式，同時設立備班人員2~3名隨時待命，以及時應對突然增加的樣本量。本實驗室新型冠狀病毒核酸檢測規范有序，未發生一起因新冠病毒核酸檢測的人員感染事件。截止2020年2月25日，檢測標本數量達21596例，平均日檢測量約600~1000例，日檢測最大量高達2000例，為患者的確診和治療做出了重要的貢獻。
目前核酸檢測是確診新冠肺炎的“金標準”，只有通過核酸檢測陽性才能確診。而事實上，新冠肺炎核酸檢測的陽性率僅為30%~50%。大量臨床病例證實有相當一批核酸陰性病人，最終卻證實為感染者，殘酷的現實讓我們不得不停下來深刻反思，核酸檢測過程中到底還存在哪些問題，而這些問題必須盡快擬定對策并予以解決。
一
當前新冠病毒核酸檢測中值得注意的問題
當前新冠病毒核酸檢測流程涉及問題較多，比如樣本采集流程不規范問題、實驗室出現核酸檢測假陰性或假陽性問題、不同廠家試劑間檢出能力存在較大差異的問題、實驗室質量控制不達標的問題、檢驗結果判讀標準未統一的問題、人員規范化培訓問題、生物安全問題等，涉及分析前、分析中和分析后全過程。
（一）分析前值得注意的問題
1.樣本采集不規范問題：樣本采集問題是影響核酸檢測結果的主要因素之一。國家衛健委發布的《新型冠狀病毒感染的肺炎診療方案（試行第五版）》中指出，在鼻咽拭子、痰、下呼吸道分泌物、血液、糞便等標本中可檢測出新型冠狀病毒核酸。對于新型冠狀病毒肺炎疑似及確診患者，本實驗室提供包括鼻咽拭子、口咽拭子、痰、糞便、尿液等臨床標本。新型冠狀病毒核酸檢測下呼吸道樣本含有病毒載量更多，但是由于采樣不方便或病人無痰，導致目前主要標本類型仍為上呼吸道樣本，比如鼻咽拭子。根據病人病程、醫護人員取樣操作的規范程度不一致會出現采樣量不均一的問題，最終導致假陰性增高。鼻咽拭子采樣時要規范，“三個要”要做到，即要深、要轉、要取細胞。“要深”即距離從耳垂到鼻尖長度的一半，“要轉”即轉動10~15秒，轉動4~5圈，“要取細胞”即取到鼻咽部的細胞。若鼻咽拭子無法采集時，可考慮口咽拭子采樣，取樣關鍵點要注意用拭子擦拭雙側咽扁桃體及咽后壁3~5次。取樣完畢后，將拭子頭浸入含3ml病毒保存液管中，尾部棄去，旋緊管蓋。為提高檢出陽性率，可考慮采用鼻咽拭子和口咽拭子同時采樣，采樣后放入同一管病毒保存液中。
2.樣本保存與運輸問題：鼻咽拭子冠狀病毒含量最少，容易造成漏檢；其次新冠病毒為RNA病毒， RNA在空氣中容易降解。樣品取樣保存、運輸過程中都有可能出現降解的問題。我科檢測的樣本來源較多，目前本實驗室除承擔武漢大學人民醫院本部、東院區及的方艙醫院和武漢市第九醫院的新冠標本外，還同步接收來自武漢及湖北省其他地市級不同區疾控的送檢標本，涉及送檢機構達46家。因為新冠病毒RNA比較容易降解，所以我們檢測總體原則是建議樣本采集后室溫放置不超過4小時，2℃~8℃不超過72小時，超過72小時時應該在-70℃保存，且采集的樣本運輸時需放置專用的轉移箱中進行。
3.樣本前處理問題：未經滅活的樣本對實驗人員存在較大安全隱患。我科通過設計嚴謹的實驗方案，終于摸索出較為合適的樣本滅活條件，即采用56℃滅活45分鐘預處理采集的標本后再進行核酸檢測，且該條件對新型冠狀病毒核酸檢測結果無影響[ ]。因此，建議對采集的樣本，恒溫箱或水浴箱56℃滅活30分鐘~45分鐘后，再進行提取核酸。
（二）分析中值得注意的問題
1.核酸提取環節問題：核酸提取分為手工提取和機器自動提取兩種。手工提取過程復雜，步驟繁多會顯著增加交叉污染概率，而全自動核酸提取儀系統內一旦出現核酸氣溶膠會導致檢測“假陽性”，進而導致交叉污染出現假陽性結果。本實驗室主要采用的是Smart LabAssist全自動提取儀和圣湘生物 Nathch CS 全自動核酸提取儀，但前者提取效率更高一些，每批次平均周期為45min。核酸提取嚴格按照試劑說明書進行，本實驗室的經驗是每批次提取完成后，提取儀噴灑核酸清除劑，然后用紙擦拭干凈，再用75%酒精噴灑擦拭（磁棒除外），開紫外消毒半小時，按照此消毒方法能最大程度減少核酸提取環節的污染。
2.核酸擴增環節問題：建議采用中國國家衛生健康委推薦的或經過實驗室驗證的新型冠狀病毒核酸檢測試劑盒。每批次建議使用一個弱陽性質控和三個陰性質控，三個陰性質控隨機放置不同位置。為提高報告的準確性和檢測的靈敏度，減少灰區，各個實驗室應摸索PCR擴增體系，必要時可以適當擴大反應體系至40ul或50ul。
（三）分析后值得注意的問題
1.結果的判讀問題：由于新型冠狀病毒核酸檢測試劑盒僅設有陰性對照和陽性對照，檢測結果判讀務必謹慎。我科根據國家衛生健康委推薦和武漢大學人民醫院檢測數據綜合分析，將結果判讀及解釋及時進行了匯總[ ]。目前新型冠狀病毒核酸檢測試劑盒檢測主要分為開放性閱讀框中的特異性片段ORF1ab、核殼蛋白基因N片段和包膜蛋白基因E片段三個基因片段或開放性閱讀框中的特異性片段ORF1ab和核殼蛋白基因N片段二個基因片段。本實驗室通過對大數據進行分析總結如下：ORF1ab和N基因二個均陽性時，結果判定為陽性；若僅ORF1ab或N單基因陽性時，需重新采樣復查，復查后單基因仍為陽性時，則判定為陽性；若ORF1ab或N基因檢測結果處于灰區時，需重新采樣復查，若結果仍為灰區但擴增曲線有明顯起峰時則判為陽性，否則為陰性。
2.生物安全問題：本實驗室制定了嚴格的實驗室個人防護和消毒流程。樣本采集時和進入實驗室前，務必采用生物安全三級防護方可進入，即戴N95口罩、戴帽子、穿一次性隔離衣、防護服、防護靴套、戴護目鏡或面罩、戴雙層手套等。檢測工作結束后，在PCR實驗室緩沖間按規范流程脫掉護目鏡、防護服、口罩和帽子等后再出實驗室。工作人員離開實驗室必須洗手和手消毒。護目鏡放入高效含氯消毒液（2000mg/L）中浸泡至少60min，消毒后用清水沖洗可再次使用。消毒流程分四個環節，首先是實驗室空氣消毒，每次試驗后所有房間采用移動式紫外燈消毒1小時，走廊進行紫外消毒30分鐘；其次工作臺面消毒，每天試驗后使用0.5%~1% 有效氯消毒臺面和地面；再次是生物安全柜消毒，每天試驗后用75%酒精對生物安全柜進行擦拭，再開紫外燈消毒1小時；最后還要對轉運容器進行消毒，轉運及存放標本的容器使用前后及時用 75%酒精進行擦拭或噴灑消毒。
（四）實驗室質量控制問題
1.嚴格室內質量控制：2020年01月28日湖北省臨床檢驗中心下發了文件《新型冠狀病毒感染的肺炎實驗室檢查及病毒核酸檢測質量控制要求》，該文件明確規定了新冠核酸檢測每批次必須設立一個弱陽性質控、三個陰性質控（病毒保存液），三份陰性質控隨機放在臨床樣本中間。弱陽性質控測定為陽性，三份陰性質控全部測定為陰性，視為在控。反之，則為失控，不可發出報告，應分析原因，必要時重新檢測樣本。本實驗室一直嚴格按照上述室內質控要求，每批次設立一個弱陽性質控、三個陰性質控（生理鹽水），室內質控在控方能審核報告。嚴格的室內質量控制有效的保證的新冠病毒核酸檢測的準確性。
2.不同檢測試劑盒的比對驗證：目前實時熒光RT-PCR 檢測2019 新型冠狀病毒（2019-nCoV）核酸陽性是新型肺炎診斷的金標準。核酸檢測具有早期、敏感、特異性高、易操作等優勢，但對于核酸檢測結果的準確性，需要從樣本類型、質量控制、實驗因素、檢測試劑盒性能等多方面進行考慮。在排除了樣本問題、室內質控等諸多因素后，需要對檢測試劑盒性能進行評價。本實驗室發現國產各種新冠核酸檢測試劑盒對弱陽性樣本的檢測能力參差不齊，少數試劑對 2019-nCoV(ORF1ab和N 基因)均能檢出，而部分試劑只能檢測出其中一個。目前共有10款新冠病毒檢測試劑盒通過“應急通道”獲批上市。本實驗室分別比較了圣湘生物、華大基因、上海之江、達安基因、上海捷諾、上海伯杰6種試劑盒新冠檢測結果，結果發現其陰性符合率均在90%以上，而陽性符合率最高僅為72%，其主要原因與試劑引物設計有關及各位點檢測靈敏度相關，其主要原因一是可能與試劑引物設計有關，二是與各位點檢測靈敏度相關。弱陽性樣品往往對試劑盒的靈敏度有較高要求，如果最低檢出限達不到樣品的檢測濃度，則會導致假陰性結果。
（五）人員安排不合理問題
面對新冠疫情升級，對實驗室進行規范的核酸檢測提出了嚴峻的考驗。面對一種具有較高傳染性的新病毒，一線檢測人員首先在心理上恐懼的，其次未經規范化培訓的人員上崗可能會導致其勝任崗位能力不夠，再次是未建立規范化檢測流程，最終可能會導致人員安排不合理的情況。為最大程度發揮人員作用并避免實驗室污染，我科的建議是采用模塊化操作，即每個分區的操作人員固定，避免人員在不同房間之間走動，采用流水式工作流程，每個房間配備對講機，不同分區人員采用對講機及時溝通，可顯著提高核酸檢測效率。具體的人員分工可劃分為四個環節：（1）樣本接收、錄入LIS系統與樣本滅活，（2）提取病毒核酸（3）PCR擴增試劑配制，上機并審核發放報告（4）報告結果解讀。
二
影響新冠病毒核酸檢測假陰性或假陽性的主要因素
1.影響新冠病毒核酸檢測假陰性因素：
檢測結果出現“假陰性”的主要原因有樣本質量差，比如口咽等部位的呼吸道樣本；樣本收集得過早或過晚；沒有正確地保存、運輸和處理樣本、不同試劑盒檢測能力不一致等因素。
（1）樣本來源不一致：鼻咽拭子結果隨機性較高，不如深部痰液標本結果可靠。
（2）采樣的有效性：臨床是否真正按規范采到了感染的樣本細胞。
（3）采樣的時機：早期感染可能在肺部的邊緣，病毒在樣本中含量很少或沒有，導致檢測顯示為陰性。
（4）采樣后的樣本保存和運輸：采樣后如果室溫間隔時間太長（超過4h），容易導致病毒核酸降解，從而導致檢測結果為陰性。
（5）不同來源試劑盒檢出率不同：本實驗室前期研究已表明國內不同試劑盒陽性檢出率差異較大，部分試劑盒會導致假陰性率顯著升高。
（6）各實驗室檢測結果解讀不一致：在檢測結果解讀時，有些試劑說明書上描述需2個靶標同時陽性才可報陽性，只有一個靶標陽性的這部分檢測結果被定為陰性，其中可能混雜了一部分“假陰性”。按照國家衛健委發布的《新型冠狀病毒肺炎防控方案（第五版）》要求，各實驗室檢測結果解讀要統一，即ORF1ab和N基因二個均陽性時，結果判定為陽性；若僅ORF1ab或N單基因陽性時，需重新采樣復查，復查后單基因仍為陽性時，則判定為陽性。本實驗室認為處于檢測結果位于灰區時，仍需重新采樣復查，若結果仍為灰區但擴增曲線有明顯起峰時則判為陽性，否則為陰性。
2.影響新冠病毒核酸檢測假陽性因素：
（1）核酸提取不當：隨著新冠樣本不斷增加，實驗室核酸提取面臨著巨大的考驗。核酸提取環節如果處理不當極易出現核酸污染而產生“假陽性”結果。手工提取過程復雜，步驟較多容易產生交叉污染；常規磁棒法全自動核酸提取儀因磁棒磁力下降可導致磁珠殘留或系統內核酸氣溶膠濃度增高而出現“假陽性”結果。
（2）液體處理過程中的交叉污染：疫情爆發后，新冠核酸檢測人員本身面臨較大的心理壓力，特別當標本量過大及復檢次數增多時，檢測人員面對復雜的檢測試劑較容易出現樣本的錯加、漏加等情況，這都可能成為假陽性或假陰性產生的主要來源。
（3）檢測結果判讀不合理：實驗人員的技術能力也是產生假陽性的重要因素，如熒光定量PCR結果判定時，閾值取舍不合適，會直接導致假陽性的發生。
（4）檢測人員未經過嚴格培訓：檢測操作時未遵守規程，如檢測的樣品在生物安全柜外開蓋、不同分區物品混用、實驗操作時未按分區進行單向流動、遇到污染的情況能及時進行處理等，以上情況均會導致PCR實驗室發生核酸污染。
三
全面提高新型冠狀病毒核酸檢測質量和效率的對策
保證試劑盒質量、規范采樣/保存/運輸流程、保證核酸提取質量、選擇靈敏度和特異性較高的試劑盒及優化核酸檢測流程等，這些都是保證新型冠狀病毒核酸檢測結果快速準確的有效手段。
1.規范標本采集方法：目前比較常見的采樣方法是使用鼻咽拭子、口咽拭子、痰液、血液、糞便或肺泡灌洗液等。條件許可的情況下盡可能采集下呼吸道標本，特別是支氣管肺泡灌洗液（BALF）標本或深部痰，陽性率更高。掌握采集標本的時機，早期鼻咽拭子為主，晚期BALF為主。規范鼻咽拭子、咽拭子的操作程序；同時做好采集人員的防護（醫用N95口罩、護目鏡、手套、防護面罩、防護服等）。采用合格的（高質量的材質）鼻咽拭子和咽拭子，規范實驗室檢測的操作流程，保證實驗結果的可靠性和正確的解讀結果。
2.改進標本的運送：及時采集標本，及時送檢標本。降低RNA病毒核酸的降解，樣本存放于專用的病毒保存液中，在4~6℃狀態下保存并盡快運輸送檢。加快檢測速度，減少標本等待檢測的時間。在具備專業能力的實驗室進行檢測。
3.保證核酸提取質量：新冠樣本核酸提取過程非常重要，整個流程中如果有一個已知定值定量的類似樣本作為標準品進行全流程監控和結果檢驗，將會對檢測有效性和結果準確率提供很好的質量保證。
4.選擇靈敏度和特異性較高的試劑盒：為了緊急應對此次武漢新冠肺炎疫情，國家食品藥品監督管理局啟動應急審批程序批準了10個新型冠狀病毒核酸檢測試劑盒。本實驗室通過對實驗室使用過的新冠核酸檢測試劑盒檢測能力進行驗證分析，發現國產不同試劑盒對弱陽性樣本的檢測能力參差不齊，少數試劑對 2019-nCoV(ORF1ab和N 基因)均能檢出，而部分試劑只能檢測出其中一個或擴增曲線處于灰區。每個實驗室應在能力范圍內對所用試劑盒進行性能驗證，盡可能選擇靈敏度和特異性較好的試劑盒來提高其檢出率和可靠性。
5.努力規范和優化實驗室核酸檢測流程：新型冠狀病毒核酸檢測是病例確診的關鍵環節。檢測人員在按要求充分做好生物安全防護時，必須要按規范處理流程保障檢測結果的準確性。首先檢測人員著三級防護裝備從密封箱中拿出裝有咽拭子樣本的取樣管，仔細核對取樣人的姓名，并在電腦上錄入相關信息；在拆開樣本之前，采用75%的酒精噴一次，消毒后再進行水浴滅活，溫度為56℃? 45min；之后進入P2及以上負壓實驗室的生物安全柜內打開樣本，進行手工或全自動核酸提取；與此同時按提取樣本份數配置相應的PCR擴增試劑，再通過傳遞倉傳輸至核酸提取室，擴增試劑加入核酸模板后再傳遞至PCR擴增區進行擴增、數據分析和結果審核，檢測完畢后進行嚴格的終末消毒程序，包括空氣消毒、工作臺面和地面消毒、生物安全柜消毒、轉運容器消毒。
四
對當前新冠病毒核酸檢測的主要體會和建議
在湖北省武漢市爆發新冠肺炎后，武漢大學人民醫院于2020年1月20緊急啟動了新型冠狀病毒核酸檢測。在此次抗擊疫情過程中本實驗室積累了以下寶貴的經驗。
1.制訂《新型冠狀病毒核酸檢測臨床實驗室操作規范》，進一步規范了標本的采集流程、檢測流程及生物安全防護流程，及時為全國檢驗同行提供了可行的實驗室操作及病毒的滅活規范。
2.本實驗室通過制作鼻咽拭子采集視頻及采集示意圖等手段有效地指導了臨床各科室進行樣本規范化采集。
3.優化科室各項管理工作：特別在人員配置、設備安置、檢測試劑性能評價和生物安全防護等方面進行了合理化調整，并指定專人負責，實驗室核酸檢測實行全天24小時4班輪換工作方式，工作效率顯著提高。
4.制定規范的新冠核酸檢測結果解讀制度：根據國家衛生健康委推薦和武漢大學人民醫院檢測數據綜合分析，進一步制定了結果解讀規范，并撰寫入“新型冠狀病毒核酸檢測臨床實驗室操作規范的建議”中。
5.制定新冠肺炎疑似患者入院和確診患者出院檢測流程：本實驗室同時給臨床提供系列非新型冠狀病毒肺炎鑒別診斷項目，加速新型冠狀病毒肺炎疑似患者分流的速度。
6.積極主動承擔防疫責任，協調其他醫療機構新冠標本送檢至我院：始終以“隔離病毒，不隔離愛”為己任，同步接收來自武漢市或地市級區疾控及部分定點醫院和聯盟單位標本，涉及送檢醫療機構達46家，目前累計接收外單位送檢標本達11487人次。
本次新冠疫情給湖北武漢帶來了災難性的打擊，但全體醫務人員始終堅持抗戰在一線，始終堅信有黨中央和全國人民的支持，通過我們的勤奮努力和舉一反三一定可以打贏這場抗疫攻堅戰。希望我們的寶貴經驗能為全國核酸檢測實驗室提供幫助。在接下來的日子里，本實驗室仍然會持續改進核酸檢測的各個環節，高效率的為臨床服務，最大程度的為患者早診斷早治療爭取時間。
注：本文來源于《臨床實驗室》2020年第3期“新冠病毒實驗室診斷”專刊