新型雙堿基編輯器助力基因飽和突變文庫構建

近日，中國科學院廣州生物醫藥與健康研究院研究員賴良學課題組在新型堿基編輯器開發方面取得重要進展，獲得了可同時兼具當前多種單堿基編輯器及CRISPR/Cas9基因編輯功能的多功能堿基編輯器，可廣泛地誘導產生多種模式的突變，對于飽和突變文庫構建、基因突變功能研究等方面具有重要促進作用。相關研究在線發表于《核酸研究》（Nucleic Acids Research）。

基因單核苷酸變異（SNV）與基因功能密切相關。基于日漸普及的高通量測序技術，研究人員在動植物乃至人類基因組中發現了大量的SNVs。這些細微的基因差異中的部分已經被證實與動植物的性狀變異相關，也與人類遺傳疾病的發生發展或藥物療效存在密切聯系。但是目前仍有大量SNV的功能尚未得到明確，如何揭示這些遺傳變異與物種性狀及臨床表型間的關聯，是農業分子育種和精準醫學研究等領域向前推進時亟需解決的瓶頸。

基因飽和突變文庫是研究基因SNV功能的重要工具。利用基因編輯技術在基因特定區域中引入不同類型的堿基突變，并以其為基礎進行功能性篩選，可以實現基因SNV功能的高通量研究。

近年來，基因突變文庫構建主要借助CRISPR/Cas9系統在目標區域內引入移碼突變破壞基因表達，從而根據表型鑒定基因功能。這種方式也可以誘導基因SNV的產生，但是效率極其低下，不適合用于與基因SNVs相關的飽和突變文庫的高效構建。David Liu實驗室開發的堿基編輯器（BE）為飽和文庫的構建帶來了技術上的突破。BE系統可以在基因特定區域引入高效的單堿基轉換，因此被迅速應用于與DNA損傷應答或癌癥相關的基因SNVs功能的高通量篩選等研究中，并取得了突破性的成果。但現有的BE只能實現一種或兩種類型的堿基轉換，不能滿足飽和突變文庫對編輯產物多樣性的需求，因此，亟需建立可以誘導多種類型堿基轉換的基因編輯工具。

該研究將腺嘌呤堿基編輯器（ABE）和糖苷酶堿基編輯器（CGBE）結合，開發出一種新型的雙堿基編輯器——AGBE。它可以利用單個向導RNA（sgRNA）誘導同一等位基因的靶序列單獨或同時發生包括A-to-G、C-to-G、C-to-T和C-to-A等4種不同類型的堿基轉換。隨后，研究人員在永生化細胞系、原代細胞和胚胎細胞等多個哺乳動物的細胞體系中驗證了AGBE系統的有效性。結果表明，與單獨的ABE和CGBE相比，AGBE極大地拓寬編輯窗口（從4-8到3-13），在此基礎上通過將不同類型的堿基轉換進行組合，可以大幅度地增加編輯產物的多樣性，從而構建出含有更多基因突變類型的突變文庫。令人驚喜的是，研究人員通過分析全基因組和轉錄組測序數據，發現AGBE并不會引起明顯的DNA或RNA水平的脫靶效應，證明了該系統是一款高效且安全的堿基編輯工具。

研究人員挑選了人類白喉毒素受體基因hDTR用于驗證AGBE在基因飽和突變文庫構建中的應用潛能。當hDTR基因發生突變時，會改變人類細胞對白喉毒素的敏感性，結合白喉毒素篩選和富集，可以快速獲得具有白喉毒素抗性的突變文庫，從而分析hDTR基因的SNV與藥物敏感性間的聯系。研究結果表明，在針對hDTR基因的關鍵功能域設計的32條sgRNA中，有20條可以賦予細胞抵抗白喉毒素的能力，產生了多達59269種不同類型的等位基因突變產物，并從中篩選出對白喉毒素有不同敏感性的突變細胞株。以上結果充分證實了利用AGBE系統進行基因SNVs功能高通量研究的可行性和高效性。

在本項研究中，賴良學課題組梁艷慧博士、謝精科博士、張全軍助理研究員和王曉民博士為該論文共同第一作者，賴良學研究員和王可品副研究員為共同通訊作者。該研究工作得到了國家自然科學基金、國家重點研發計劃、廣東省科技計劃、中國科學院青年創新促進會和中國科協青年人才托舉工程等項目的資助。