新型離子交換柱應用歸納

圖1.  不同粒度填料在不同流速下的壓力對比。色譜條件：柱尺寸，4.6mm ID× 3.5cm；流動相，20mmol/L Tris-HCl（pH8.5）。

本文實驗通過對蛋白、核苷酸等樣品分離，考察了新型無孔離子交換色譜柱的分離性能。結果表明，該類色譜柱可以在較低的柱壓下實現對各種生物樣品的高分辨、高通量分析和痕量制備。

隨著生物制藥行業的快速發展，對生物樣品高通量、高分辨率的分離需求變得越來越急迫。針對這一需求，東曹公司開發了新型可用于生物樣品高分離、快速分析的無孔離子交換色譜柱—TSKgel STAT系列色譜柱。本文通過一系列樣品分析實驗考察了該系列色譜柱的性能。樣品類型包括PCR產物、PEG化β-乳球蛋白、單克隆抗體、核苷酸等生物樣品。

圖2.  樣品上樣量依存關系比較。色譜條件：柱尺寸，4.6mm ID×3.5cm；流動相，A為20mmol/L Tris-HCl（pH8.5），B為0.5mol/ L Tris–H~100%（10min.）；樣品，1為伴白蛋白，2為卵清蛋白；檢測，紫外280nm。

實驗部分

儀器和主要試劑

HLC 8020高效液相色譜儀（日本Tosoh），Tris-HCl、NaCl等其他試劑均為AR級。色譜柱為TSK-GEL STAT系列色譜柱（日本Tosoh）。

圖3.  PCR產物色譜圖和電泳圖。色譜條件：色譜柱，TSKgel Q-STAT 4.6mm ID×3.5cm (10μm) ；流動相，A為20mmol/L Tris-HCl（pH8.5），B為1.0mol/L NaCl in A（pH8.5）；梯度，B為0% ~100%（1.5min）；流速，2.0 ml/min；檢測波長， UV 260nm。

結果與討論

壓力與樣品載量考察

實驗對比考察了TSKgel Q-STAT系列色譜柱與以前開發的TSKgel DEAE-NPR（2.5μm）色譜柱的流速與柱壓、上樣量的依存關系，實驗結果見圖1和圖2 。結果表明，在相同流速下，TSKgel Q-STAT系列色譜柱較以前的無孔離子交換色譜柱TSKgel DEAE-NPR，柱壓降明顯降低。在進樣量范圍內，隨著進樣量的提高，分離度未有明顯降低。新開發的TSKgel Q-STAT系列色譜柱的上樣量較TSKgel DEAE-NPR色譜柱有顯著提高。

圖4.  β-乳球蛋白的PEG化過程監測色譜圖。

PCR產物的分離純化

采用強陽離子交換色譜柱TSKgel Q-STAT對核酸樣品的PCR產物進行了分離制備，收集PCR產物餾分并采用瓊脂糖凝膠電泳進行了分析，分析結果見圖3。實驗結果表明，該色譜柱可以在2min內完成樣品分析和痕量制備，滿足電泳分析對樣品量的需要。

PEG化β-乳球蛋白的分離）

采用強陽離子交換色譜柱TSKgel SP-STAT對β-乳球蛋白的PEG化過程進行監測，分析結果見圖4。實驗結果表明，該色譜柱可以在2min內完成分析，實現對β-乳球蛋白PEG化過程每5min進行1次監測。

圖5.  單克隆抗體電荷異構體的分離色譜圖。色譜條件：色譜柱，TSKgel CM-STAT, 4.6mm ID×10cm（7μm）；流動相，A為20mmol/L MES buffer （pH6.0），B為0.1mol/L NaCl in A （pH6.0）；梯度條件，B為20%~50%（30min）；樣品，MAb樣本；流速，1.0ml/min；檢測波長，UV 280nm。

色譜條件：色譜柱，TSKgel SP-STAT, 4.6mm ID x 3.5cm（10μm） ；流動相，A為20mmol/L Na acetate buffer（pH4.5），B為0.8mol/L NaClO4 in A（pH4.5）；梯度條件，B為0~30%（2min，線性）；流速，4.0ml/min；分析間隔時間，5min。

單克隆抗體的分析

采用弱陽離子交換色譜柱TSKgel CM-STAT對單克隆抗體樣品進行了分離，分析結果見圖5。實驗結果表明，在SDS-PAGE上無法實現分離的單克隆抗體電荷異構體樣品可以在該色譜柱上實現很好的分離。

圖6.  核酸樣品的分離色譜圖。色譜條件：色譜柱，TSKgel DNA-STAT 4.6mmID×10cm （5μm） , DNA-NPR 4.6mm ID×7.5cm；流動相，A為20mmol/L Tris-HCl （pH8.5），B為1.0mol/L NaCl （pH8.5）；梯度條件， B為50%~75% （20min） for DNA-NPR，75%~100% （20min） for TSKgel DNA-STAT；樣品，DNA 1kb Ladder；流速，0.5ml/min；檢測波長，UV 260nm。

核酸樣品的分離

實驗采用核酸樣品（1kb DNA Ladder）對比考察了TSKgel DNA-STAT色譜柱與以前開發的TSKgel DNA-NPR（2.5μm）色譜柱的分離情況，分析結果見圖6。實驗結果表明，在優化實驗條件下，核酸樣品可以在TSKgel DNA-STAT色譜柱上獲得更好的分離。

結論

TSKgel STAT系列色譜柱可以在較低的柱壓下實現對各種生物樣品的高分辨率、高通量的快速分析和痕量制備。