新方法快速可靠地定量單細胞中的mRNA和蛋白

　　在單細胞水平上分析基因表達是一項艱巨的任務，往往需要專門的設備。為此，加拿大麥吉爾大學的研究人員開發出一種快速可靠的方法，能夠定量單細胞內多個基因的mRNA和蛋白水平。

　　通過揭示細胞之間的個體差異，單細胞分析克服了細胞異質性的問題。不過，在單細胞水平上分析基因表達是一項艱巨的任務，往往需要專門的設備。

　　為此，加拿大麥吉爾大學的研究人員開發出一種快速可靠的方法，能夠定量單細胞內多個基因的mRNA和蛋白水平。這項題為“Protein and RNA quantification of multiple genes in single cells”的研究于1月發表在《BioTechniques》上。

　　目前測定mRNA和蛋白表達的分析通常在大量細胞或組織上開展。大量細胞的采用可提高結果的可靠性，并克服靈敏度低或信噪比低的問題。然而，即使是組織中相鄰的細胞，也未必是同質的。如此獲得的平均數據錯過了重要的個體差異。因此，單細胞分析成為當今的熱潮。

（圖片來自原文）

　　早前，麥吉爾大學的研究人員曾開發出一種技術，可定量體內單細胞中的蛋白質水平。這種蛋白定量比值法（PQR）采用一種遺傳標簽，這種標簽在蛋白翻譯期間產生特定比例的熒光蛋白和目標蛋白。熒光強度與目標蛋白的分子數成正比，因此可用于確定細胞內的相對蛋白量。利用基因編輯工具，PQR載體可插入任何內源的基因座。

　　如今，研究人員將蛋白質定量方法與mRNA定量方法相結合，以便在轉錄和翻譯水平測定基因表達。在測定熒光強度后，他們將同一細胞裂解后提取RNA，然后用單細胞qPCR對mRNA的豐度進行定量。

　　在原理驗證研究中，他們選擇了產生抗體的小鼠雜交瘤細胞系22c10，因為細胞較大，容易操作，并且不斷分泌含有κ免疫球蛋白輕鏈的抗體。在κ輕鏈基因的外顯子后插入PQR–RFP報告基因，可確保每個κ輕鏈蛋白在翻譯時產生一個RFP分子。同時，他們以RPL13a基因作為看家基因。

　　為了確定轉錄和翻譯水平上基因表達之間的關系，研究人員以IgK和RPL13a為對象，分析了mRNA與蛋白水平之間的關系。他們發現了一些有趣的差異，表明不同基因的mRNA-蛋白關系存在差異。例如，RPL13a的mRNA水平和蛋白水平無關，相關系數為0.1，而IgK的mRNA水平卻可以很好地預測蛋白水平，相關系數為0.44。

　　研究人員指出，這種技術產生了每個基因的兩個指標，因此能夠關聯不同基因的mRNA和蛋白水平。這有助于單細胞水平上多個基因的mRNA和蛋白差異表達的研究。人們可以利用看家基因來標準化mRNA和蛋白測定，還可以利用這種技術來判斷不同疾病狀況下多個基因是否受到共同調節。

　　這種技術只需要標準熒光顯微鏡和實時定量PCR儀，適合所有實驗室使用。它適用于各種細胞類型，如神經元、免疫細胞、貼壁細胞或懸浮細胞，并且適合各種方法獲得的單細胞，如解離組織、FACS分選等。整個流程只需要2.5小時。