實驗室檢查對確定肝脾腫大原因和判定肝臟功能極為重要，有時臨床癥狀并不明顯但化驗檢查已顯肝功能異常。實驗室檢查對評估肝臟損害程度及其預后也是必不可少的。
1.血液檢查
（1）血象 白細胞計數和細胞形態觀察對感染性疾病、白血病有診斷價值。血紅蛋白、紅細胞減少，網織紅細胞增加，提示溶血性貧血。
（2）血液膽紅素定量、定性檢查 對診斷黃疸伴有肝脾腫大是不可缺少的檢查項目。測定血清膽紅素濃度是新生兒肝大最常做的化驗，新生兒期血液病是新生兒黃疸最常見原因之一，很多肝大伴有黃疸的病都需要與其鑒別，尤其在生后第1周內。若血清膽紅素持續增高至生后2周以上，并且以直接膽紅素增高為主，便應考慮為肝臟疾病。
（3）肝功能檢查 肝功能、乙型肝炎表面抗原（HBsAg）、乙型肝炎核心抗原和E抗原的檢查，對診斷新生兒肝炎綜合征是否由乙型肝炎病毒引起，是重要的依據。肝功能試驗中的腦磷脂絮狀試驗、硫酸鋅濁度試驗等，在新生兒期常不呈陽性反應。谷丙轉氨酶和谷草轉氨酶在心臟和肌肉組織中含量也較多，窒息缺氧后此類酶可大量釋放至血流。乳酸脫氫酶在肝炎時增高，阻塞性黃疸時不增高，提示膽汁郁積的酶有堿性磷酸酶、亮氨酸氨基轉肽酶和γ-谷酰轉肽酶等，血清5′-核苷酸酶在膽道閉鎖時也明顯增高。
（4）病原學檢查 血液細菌培養、病毒分離及特異性抗體的檢測，可幫助確定引起感染的細菌和病毒的種類。
（5）其他試驗 如疑有糖代謝異常者應測定血糖及糖耐量試驗。為確診血型不合溶血病須做抗人球蛋白直接試驗、游離抗體測定和抗體釋放試驗。血清蛋白電泳、甲種胎兒蛋白、免疫球蛋白等檢查可根據需要酌情選做。
2.骨髓檢查
考慮有血液病或惡性細胞增生時應做骨髓穿刺，對診斷白血病、血小板減少性紫癜、瘧疾等是很有價值的。
3.肝活組織檢查
對診斷不明的肝脾腫大或疑為腫瘤者，可考慮肝脾穿刺后取活體組織檢查，對確定新生兒肝腫大的性質很有幫助。如確診肝原發性腫瘤或繼發性腫瘤，區別新生兒肝炎綜合征和肝內膽管閉鎖等。
4.B型超聲檢查
超聲波檢查可幫助確定肝脾的大小，特別在小兒腹脹嚴重而使肝脾觸及不清時尤為必要。應用超聲掃描可觀察肝臟位置、形態、大小，檢查橫膈運動，顯示肝臟與相鄰器官的關系。超聲波檢查還可提供病因學資料，如新生兒肝炎時基本波型呈密集微波和密集微小波；新生兒肝癌為叢狀波、遲鈍波和出波衰減；肝膿腫可見液平段等。B型超聲對肝囊腫、肝膿腫和肝腫瘤等肝內腫物的鑒別極有用，肝硬化、脂肪肝和淤血肝也能在超聲圖像下區別。膽囊超聲波檢查可發現膽總管囊腫的存在。
超聲檢查可以觀察脾臟的位置、形態和大小，新生兒合作程度、腹肌緊張和腹水等因素對其影響較小。利用超聲檢查判斷脾大較觸診更敏感和正確，并可顯示內部結構，可區別淤血性脾腫大、淋巴肉芽腫、脾的原發性腫瘤和脾被膜下血腫等。
5.放射性核素檢查
放射性核素檢查也可用于肝脾腫大的診斷，膠體Tc用于了解肝臟的位置、形態、大小和探測肝內有無占位病變。脾臟可與肝同時顯影，脾功能正常時，脾影較肝右葉淡，脾功能亢進時，脾影可濃于肝影，對脾內占位病變和浸潤病變的診斷，也很有用。