新生大鼠、新生小鼠及雞胚背根神經節分散細胞培養

   背根神經節（DRG）細胞起源于神經嵴，NGF Levi-Montalcini的實驗表明，外原性NGF能刺激DRG細胞生長發育并形成廣泛的神經網絡。在體外，分離培養的神經節在NGF存在的情況下，神經突起的生長在一天之內可長達數毫米，因此，利用培養的DRG細胞，進行軸突生長發育的研究，是最為經典而常用的方法之一。二氧化碳培養箱是通過對周圍環境條件的控制制造出一個能使細胞/組織更好地生長的環境，條件控制的結果就會形成一個穩定的條件：如恒定的酸堿度（pH值：7.2-7.4）、穩定的溫度（37°C）、較高的相對濕度（95％）、穩定的CO2水（5％）。因此，動物細胞的培養少不了用它。

       1、材料和方法

取新生一天的大鼠(wistar種)和小鼠(昆明種)。用眼科剪在無菌條件下除去背部皮膚, 然后剪取一段脊髓,背側朝上置于滅菌毛玻璃片上,在解剖顯微鏡下沿椎管兩側水平剪除腹側一半椎骨,暴露脊髓和神經節,用解剖鑷分離出神經節。雞胚背根神經節的取材方法同前。 剝除神經節被膜, 用0.125%胰蛋白酶消化(37℃ 30min)分散后用種植(Plating)培養液稀釋成0.2×105 個細胞/ml密度的細胞懸液，接種于涂有鼠尾膠的35mm塑料培養皿中,每皿2ml細胞懸液置。置標本于二氧化碳培養箱中培養。24h后傾去培養皿內種植培養液，改用飼養(Feeding)培養液培養。接種第3d, 在培養皿中分別加入細胞分裂抑制劑5-氟-2'-脫氧尿苷15μg/ml和尿苷35μg/ml以抑制非神經細胞的增殖, 作用48 h后更換新鮮飼養培養液，以后每周換液兩次, 每次更換一半新鮮飼養培養液。

       2、培養液成份

種植培養液：80%Eagle's DMEM(含葡萄糖600mg/100ml、NaHCO3 3.7g/L)；10%胎牛血清；10%馬血清；NGF 20ng/ml；谷氨酰胺100μg/ml。脫氧核糖核酸酶 I 40μg/ml。

飼養培養液: 95%Eagle's DMEM(含葡萄糖600mg/100ml、NaHCO3  3.7g/L,)；5 % 馬血清；NGF 20ng/ml；神經營養素 1ml/100ml；谷氨酰胺100μg/ml。

       3、新生大鼠背根節神經元的生長分化和形態特征

新生大鼠背根節神經元接種后4h，大部分細胞可貼壁，呈圓形或橢圓形,直徑8-14μm, 胞體周圍呈現一圈光暈。神經元的細胞核位于中央或偏于胞體一側，核仁明顯，亦可見雙核神經元。接種后24h，大部分貼壁細胞開始長出突起。其中多數為具有多個突起的多極神經元，少數為雙極和假單極神經元，突起細長，并可觀察到突起末端的生長錐。除單個散布的神經元外，還常見到幾個或多個神經元聚集在一起，它們向四周發出樹枝狀的神經突起。 培養2-3d后神經元的突起逐漸增多并延長，形成稀疏的神經網絡。隨著培養時間的延長，神經元突起的主干和分枝明顯延長并增粗，神經突起網絡變得更加稠密，神經元胞體逐漸增大。大鼠背根節神經元可在二氧化碳培養箱維持培養2個月。

       4、新生小鼠背根節神經元的生長分化和形態特征

新生小鼠背根節神經元的形態結構和生長分化基本上與新生大鼠相似，但小鼠背根節神經元的胞體較大鼠稍小。神經元亦隨著培養時間的延長而逐漸增大。小鼠背根節神經元亦可在二氧化碳培養箱維持培養2個月。

       5、雞胚背根節神經元的生長分化和形態特征

雞胚背根節神經元的生長分化基本上亦與新生大鼠和小鼠相似。但雞胚背根節神經元以假單極為多見。 與大鼠或小鼠背根節培養神經元相比，神經突起分枝較少。神經元胞體稍小，神經元亦隨著培養時間的延長而逐漸增大。雞胚背根節神經元亦可維持培養2個月。