方案18.3細胞增殖的密度限制實驗

傳代用的細胞

生長培養基 維持培養基 D-PBSA 胰蛋白酶

24 孔培養板 培養皿

一、材料

無菌

1. 準備用于傳代的細胞 

2. 生長培養基 

3. 維持培養基（無血清或生長因子），含有 37KBq/ml（1uCi/ml）的 3 H-胸腺嘧啶脫氧核苷，74 GBq/mmol(2Ci/mmol）

4. D-PBSA

5. 25% 胰蛋白酶 

6. 24 孔培養板，包括直徑 13 mm 的蓋玻片 

7. 直徑 9 cm 培養皿 (細菌學級別，一個蓋玻片一個平皿）

操作步驟

1. 用胰蛋白酶處理細胞，按 1×10⁵ 個/ml 接種至 24 孔培養板，1 ml/孔，每個孔放置一個直徑 13 mm 的蓋玻片。

2. 將細胞孵育在濕潤的 CO2 溫箱中 1~3d。

3. 將蓋玻片轉移至 9 cm 細菌級別培養皿中，每個培養皿含 20 ml 培養液，將培養皿置于 CO₂ 孵育箱中。

4. 繼續進行培養，當蓋玻片上的細胞匯合時，每 2d 換一次培養液。

5. 每隔 3~4 天，用胰蛋白消化 2 個蓋玻片上的細胞并計數。當細胞在蓋玻片上變密時，就必須加 200~500U/ml 粗制膠原酶到胰蛋白酶中，為的是使細胞完全分離，以便細胞計數。

6. 當細胞停止生長時，也就是兩次計數并未顯示有明顯的增加，則加入 2.0 ml 37KBq/ml（1.0uCi/ml) 的 3 H-胸腺嘧啶脫氧核苷，達到終濃度 74 GBq/mmol(2uCi/mmol），繼續孵育細胞 24 h。

1.  處理 3 H-胸腺嘧啶脫氧核苷必須十分小心，雖然它只能發射低能量的β射線，但它能摻入 DNA，從而引起放射線損傷。因此操作時必須戴上手套，不要在垂直層流 罩中操作 H3-胸腺嘧啶脫氧核苷，而應在生物危害或細胞毒存物層流罩中操作，按照處理放射性同位素的德方法規處理廢棄的液體和固體。

2.  將蓋玻片轉移至 24 孔培養板，進行胰蛋白酶處理，以利于進行放射自顯影。細胞可在懸浮狀態下進行固定，然后滴于載玻片上進行染色制備（見 方案 16.7，無需進行低滲處理），也可用甩片機將細胞離心至載玻片上（見方案 16.4）或通過真空抽濾吸附到濾紙上（見方案 16.5）。