方案23.3乳腺上皮細胞培養實驗

RPMI 1640 胎牛血清 人血清 胰島素 氫化可的松 霍亂毒素 胰蛋白酶液

培養瓶 離心管

材料

無菌

1. 生長培養液：RPMI 1640

2. 胎牛血清（fetal bovine serum，FBS)

3. 人血清（human serum: 血庫過期的血清，澳大利亞抗原陰性）

4. 儲存備用的液體：
(a) 1 mg/ml 胰島素（Sigma)：用 6 mmol/L 鹽酸配制；
(b ) 0.5 mg/ml 氫化可的松：用生理鹽水配制；
(c) 50ug/ml 霍亂毒素: 用生理鹽水配制。

注意事項

血清和儲存備用的胰島素、氫化可的松、霍亂毒素、胰酶和胰蛋白酶應在-20°C 條件下保存。

5. TEGPED： 胰蛋白酶液，含有下列成分
(a) 13 mmol/L EGTA (ethylene glycol-bis-(β-aminoethylether) -N，N，N‘，N'-tetraacetic acid，Sigma）：10 ml，用 D-PBSA 配制；
(b) 7 mmol/L EDTA（diaminoethane tetraacetic acid，Sigma): 4 ml, 用 D-PBSA 配制；
(c) 0.2% 胰蛋白酶（Difco,B-I) Bioscience): 4 ml, 用 HBSS 配制；
(d) 1% 胰蛋白酶（Difco ,B-D Bioscience): 2 ml，用 HBSS 配制。

6. 生長培養液：RPMI 1640, 添加 15% FBS、10% 人血清、50ng/ml 霍亂毒素

7. 0.5ug/ml 氧化可的松和 1ug/ml 胰島素 

8. 50 mm Nunc 塑料培養皿或 25 cm² 培養瓶 

9. 普通容器或 20～50 ml 離心管

操作步驟

最好在醫院病房于產后 2～7d 收集乳汁。用無菌水擦洗乳房，然后用手將乳汁擠入無菌容器。一般每個病人收集 5～20 ml 乳汁。將收集的乳汁混合后，用 RPMI 1640 稀釋（1 : 1 ) , 以利于離心。

原代培養 

1. 將稀釋的乳汁離心（600～1000 g，20 min) 后，輕輕吸去上清。為了避免影響沉淀細胞，應留有少量液體。

2. 用含有 5% FCS 的 RPMI 1640 清洗細胞 2～4 次，直至上清不渾濁。

3. 用生長培養液混懸細胞，將 5ul 細胞懸液加入 50 mm 培養皿（Nunc)。然后，加人 6 ml 生長培養液，在 37°C 和 5 % CO₂ 條件下培養細胞。

4.3～5d 后換培養液，以后每周換 2 次。6～8d 出現克隆，克隆細胞生長擠掉巨噬細胞。開始時，巨噬細胞起著飼養細胞的作用。

傳代培養

5. 在 37℃ 條件下用 TEGPED (每個 50 mm 培養皿 1.5 ml) 孵育細胞 5～15 min。孵育時間根據細胞已培養時間而定。然后，混懸細胞。

6. 離心（100 g，5 min ) 后，用 6 ml 培養液混懸細胞。

7. 將細胞懸液分放入 50 mm 培養皿和 25 cm² 培養瓶，每 3 個培養皿或每個培養瓶 2 ml。

8. 加入 4 ml 新鮮培養液，將細胞懸液稀釋 3 倍。