方案23.7胰腺上皮細胞分離及培養實驗

從豚鼠胰腺組織分離細胞，用紗布或尼龍網過濾細胞懸液，將過濾的細胞懸液輕輕加于 BSA 液上面。通過 3 次連續離心和混懸細胞，使呈團狀的細胞分散。然后，將細胞接種于涂有膠原蛋白的培養器皿。

F12K 組織培養液 含有 20% 小牛血清 HBSS HBSS-DVC 葡萄糖 胰蛋白酶液 胰蛋白酶液 枸櫞酸緩沖液 凡枸櫞酸三鈉鹽 NaCl 葡萄糖 酚紅 膠原蛋白酶液 溶解膠原蛋白酶 硅化錐形瓶 吸管

Blichner 漏斗 透析管 Sidearm 瓶 聚丙烯離心管 紗布 培養皿

材料

1. 無菌

（1）F12K 組織培養液：含有 20% 小牛血清（F12K-CS20)

（2）HBSS

（3）HBSS-DVC: 不含 Ca²⁺ 和 Mg²⁺ 的 HBSS

（4）葡萄糖（Difco,0155-174,BDBiosciences)

（5）胰蛋白酶液：用枸櫞酸緩沖液配制 0.25% 胰蛋白酶液（1:250, Difco, BDBi-osciences)。 枸櫞酸緩沖液（pH7.6) 含有 3 g 凡枸櫞酸三鈉鹽、6 g/L NaCl 、5 g/L 葡萄糖和 0.02 g/L 酚紅。

（6）膠原蛋白酶液：1800U/ml，用 1XHBSS-DVC (pH 7.2) 溶解膠原蛋白酶 (GIBCO)。調整膠原蛋白酶液的 pH 至 7.2，在 4℃ 條件下用 12Kda 透析膜透析 4 h，透析液為含有 0.2% 葡萄糖的 HBSS-DVC。除去 HBSS 后，用 HBSS-DVC 重復此步驟 16～18 h 。過濾除菌，分裝成 10～20 ml，在 70℃ 以下的條件下儲存。

（7）25 ml 硅化錐形瓶（Bellco)

（8）吸管：5 或 10 ml, 大口徑（Bellco)

（9）Blichner 漏斗 

（10）透析管（SpectroPor)

（11）Sidearm 瓶:250 ml

（12）聚丙烯離心管：50 ml

（13）紗布 

（14）涂有膠原蛋白的培養皿（Biocoat，BD Biosciences)

2. 非滅菌

（1）水浴振蕩器（M5B 型，11-22-1，Backer)

（2）離心機

操作步驟

1. 配制膠蛋白原酶和胰蛋白酶（1:2) 混合消化液，加熱至 37°C 。

2. 在無菌條件下取出整個胰腺（0.5～1 g )，放人 F12K -CS20 中。

3. 剪除腸系膜和其他組織，將胰腺切成 1～3 mm 小塊。

4. 將組織塊移人盛有 5 ml 預熱的混合消化液的 25 ml 硅化錐形瓶，在 37℃ 條件下用水浴振蕩器振蕩消化（120r/min ,15 min )。加人新鮮消化液，重復此步驟 2～3 次，直至大部分組織被消化分散。

5. 每次振蕩消化后，使大的組織塊沉下，然后將上清液移入 50 ml 聚丙烯離心管。離心管盛有約 12 ml 冷 F12K-CS20 , 以中和消化液。

6. 離心（600r/min，5 min ) 后，用 5～10 ml 冷 F12K -CS20 混懸細胞，將離心管放在冰上。

7. 收集細胞懸液，經數層滅菌紗布（放人 Blichner 漏斗內）過濾。在過濾過程中，將漏斗柄插入真空瓶，輕輕吸細胞懸液。取少量細胞懸液，做定量分析。

8. 通常情況下，每毫克組織獲得 1X10⁵～2X10⁵ 個細胞，90%～95% 細胞為活細胞。

9. 將 5X10⁷～5X10⁸ 個 細胞加到 2～4 個 50 ml 聚丙烯離心管的液柱表面，每個離心管內盛有 35 ml 添加 4% 冷 BSA 的 HBSS-DVC(pH 7.2)。然后，離心 (600r/min，5 min )。此步驟對于有效地將胰腺的腺泡細胞與胰島細胞、導管細胞和基質細胞分離是至關重要的。吸取上清液，重復此分離步驟 2 次，每次分離后收集細胞，用冷 F12K-CS20 混懸細胞。

10. 用 5～10 ml 冷 F12K-CS20 收集細胞。取少量細胞懸液，計數細胞。每毫克組織獲得 2X 10⁴～5X10⁴ 個細胞，80%～95% 細胞為腺泡細胞。接種密度為 3X10⁵ 個細胞/cm²。在 72 h 內，細胞貼壁，形成克隆。