方案27.7昆蟲細胞的擴增

Sf9細胞 二甲基亞砜 Pluronic F68

生長培養液

培養瓶 旋轉培養瓶和磁力攪拌器 27°C培養箱

常規維持培養

1. 通過刮取法或用培養液沖洗細胞（( ATCC # CRL-1711 ) 或從甘藍環 Trichoplusia ni 獲得的細胞系（Tn 368 或 BTI-TN-5B1-4，也稱 “High Five ”，可從 Invitrogen 購買））法使細胞從培養瓶中脫落，或者利用在旋轉瓶中懸浮生長的細胞。

2. 用血細胞計數板計數細胞，通過用臺盼藍或萘黑染色檢査細胞的活力。

3. 以 0.5~1×10⁶ 個/ml 活細胞密度將細胞種植于旋轉培養瓶內，每 500 ml 旋轉瓶內注入 20~100 ml 細胞懸液。

4. 在 20~28°C 條件下培養細胞，以 37°C 為佳。

5. 每 48~72 h 或當細胞密度為 4~5×10⁶ 個/ml 時，將細胞稀釋至 0.5~1×10⁶ 個/ml。

6. 每 3~4 周將細胞移入潔凈的培養瓶。

7. 如果細胞群聚集，稍微加快攪拌速度，并加入表面活性劑 Pluronic F-68 [ 0.5%~1.0% (v / v ) ]，以降低剪切力。

凍存細胞（另見方案 20. 1)

1. 計數細胞，離心（1000 rpm ，約 200 g，5 min )。

2. 用 10% DMSO ( 用 FBS 配制）混懸細胞，密度為 1×10⁷ 個/ml。

3. 將細胞分裝入凍存管，然后將凍存管放在冰上 1 h。

4. 將凍存管裝入苯乙烯泡沫容器。

5. 在 -70°C 條件下將凍存管緩慢冷凍過夜（約 1°C /min )。

6. 將凍存管移入液氮凍存器中。

7. 使凍存的細胞復蘇時，將凍存管在 37°C 迅速融化。如果細胞以液相儲存，在融化加蓋容器中的細胞時應注意避免因凍存管破裂而導致受傷的危險。

8. 將細胞移入含 5 ml 培養液的 25 cm² 培養瓶。輕拍培養瓶，以便均勻地分散細胞。

9. 2~3 h 后吸去培養液。當大多數細胞貼壁時，加入 5 ml 新鮮培養液。

10. 在分離前將細胞培養 2~3 天，使細胞恢復。然后按前述方法，將細胞移入攪拌培養瓶或更大的塑料瓶。