一、樣品還原1.利用冷凍干燥離心機蒸發純化的蛋白質樣品溶液（含 0.01%~0.02% Tween-20)，直到少于 10ul。 2.加入 150ul 儲存液到含有近乎干燥的蛋白質樣品的離心管中，輕輕彈擊或振蕩離心管，使樣品徹底混勻，然后略微離心樣品。 3.加人 16ul 還原緩沖液，使 DTT 的終濃度為 15 mmol/L。 4.樣品在 40°C 孵育 4.5~5 h。 二、樣品烷基化5.還原過的蛋白質樣品溶液置于室溫。 6.加入 20ul 0.5mol/L 碘乙酸，至碘乙酸的終濃度為0.05mol/L。 7.25°C 避光反應 30 min。 三、S-羧甲基化蛋白質的回收（脫鹽和濃縮）8.將 2%~3%(約 300ng 蛋白質）的總混合物上樣到反相微孔層析柱中（50 mm X 1mm 內徑 HPLC 系統）。 在加人大量的蛋白質至 RP-HPLC 之前，用 2%~3% 的總樣品（約 300ng) 做預實驗，以確定樣品能夠從反相柱上回收。這個脫鹽的預實驗極為重要，因為一些蛋白質在 S-羧甲基化后會有不同的層析結果（比如，它們比天然的蛋白質更加疏水）。如果 S-羧甲基化蛋白的疏水性比天然蛋白質的疏水性高得多，用 TFA/乙腈溶劑系統就很難從反相柱上回收蛋白質。這時可試用正丙醇代替乙腈，如果仍不行，試著用微尺寸排阻層析或快速微型脫鹽系統對 S-羧甲基化蛋白進行脫鹽。 9.一旦確定 S-竣甲基化蛋白質能夠從反相柱上回收，即可加人剩余的蛋白質樣品。 10.至于 Tween-20 調節含有 S-竣甲基化蛋白的部分（一般在 300~500ul 0.1% TFA 水溶液/乙腈中），至終濃度為0.2 g/L。關于收集到的 S-羧甲基化蛋白的酶解消化，見方案 5。 展開 | 