方案6用水溶性金屬復合體監控蛋白質蛋白質相互作用

待測蛋白質樣品

過硫酸銨4 X 凝膠上樣緩沖液甲醇PdCl25 X 反應緩沖液TMPyP三氟乙酸Tris-二吡啶釕

加熱器光交聯反應器SepPak C18 容器分光光度計注射器濾膜

一、用 Pd（Ⅱ）金屬化 TMPyP

1.將 1mg (1.2umol) 的 TMPyP 溶于 1.4 ml 水中，然后加入 0.34 mg(1.9umol) 的 PdCl2, 加熱至 95°C 反應 2 h。

實驗提示：在金屬化過程中，4 個 Q 帶峰值 518nm、554nm、584nm 和 639nm，會變為 525nm 和 558nm 的兩個峰，因此可以用可見分光光度計來監控金屬化過程。

2.冷卻樣品，并用孔徑為 45um 的注射過濾器過濾，加入 TFA 至終濃度為 1%。

3.將溶液注入用 1%TFA 平衡好的 SepPakC18 容器中，用 5 ml1% 的 TFA 沖洗容器。

4.用 0.5 ml 的甲醇，將 TMPyP-PcKII) 洗脫到一預先稱重的小離心管中。

5.甲醇蒸發后，將 TMPyP-Pd(II) 溶于 1ml 水中，在 417nm 處 [e=158X10³L/(mol·cm)] 測出其濃度。

該試劑可在冷凍避光條件下無限期保存。

二、光交聯蛋白質

警告：在使用氙燈光交聯裝置時，須戴安全的有色眼鏡以保護眼睛。

1.在 1.7 ml 的小離心管內準備總反應體積為 20W 的蛋白樣品，其中含有蛋白質、1 X 反應緩沖液和 125umol/L 的 TMPyP-Pd(II)，避光反應。

2.在光裂解反應之前，加人 5ul 新鮮配制的過硫酸銨。確保樣品管在樣品支架上呈水平狀態（即與光束平行）。

3.將 SLP 相機與光源間的擋板移開，控制快門的開啟時間為0.5s，此處可以使用相機的自動計時器。在關上快門后，將相機與光源之間的擋板重新裝上。

4.迅速加入 7 ul 4 X 上樣緩沖液，以終止反應。

5.SDS-PAGE 電泳后，考馬斯亮藍染色或 Western 印跡，對反應產物進行分析。

圖 10.26 顯示的是一個典型的交聯反應實驗結果。在這個實驗中，用上述方法使 UvsY 發生交聯反應。可以從第六列看到：只有在金屬復合物和過硫酸銨均存在的情況下，閃爍曝光光裂解交聯反應才得以發生。同時可以看到的是：在第三列上，在未加人過硫酸銨的情況下長期曝光，可發生氧分子介導的交聯反應。