Pallister -Killian綜合征(PKS)屬于染色體微缺失 綜合征的一種,可導致患兒身體不同程度殘疾?生長發 育遲緩或智力損傷等?PKS的臨床表現包括特征性顱 面畸形?先天性心臟缺損?膈疝?癲癇和皮膚色素異常 等[ 1]?PKS較為罕見,診斷困難,產前篩查是預防PKS 患兒出生的有效手段[ 2]?本研究通過無創產前基因檢 測(NIPT)診斷了1例PKS,現將結果報道如下?
1 臨床資料
孕婦,27歲,孕2產1,孕18周,否認近親婚配, 無遺傳病家族史?于外院行超聲檢查提示:胎兒先天 性膈疝,股骨?肱骨低于 M-2SD線,心臟移位至右側 胸腔,肺動脈主動脈比值增大,心包積液,三尖瓣反流 (少量)?因血清學產前篩查18 -三體綜合征高風險于 本院就診,18 -三體綜合征風險值為1/266?產科醫生 咨詢后,建議直接行羊水穿刺產前診斷,但孕婦因擔 心羊膜腔穿刺風險,自愿選擇 NIPT,在充分了解NIPT的優勢與局限性后,簽署知情同意書,并于孕 22周時進行檢測?
1. 1 NIPT 靜脈采集10mL外周血,4℃下1 600× g離心10min,取上清液2mL分裝后再次于4 ℃下 16 000×g離心10 min,獲得的血漿繼續進行游離 DNA 提取,剩余標本于-80℃保存備用?標本DNA 檢測合格后用PCR - free法進行文庫制備,采用 Next - Seq CN500高通量測序儀(貝瑞基因公司)完成36bp 的單端測序,檢測試劑盒為貝瑞基因公司生產的胎兒 染色體非整倍體檢測試劑盒(可逆末端終止測序法), 測序深度為0.3×,并進行生物信息學分析?NIPT結 果提示:13?18?21 -三體無異常,但存在12號染色體短 臂部分重復dup(12)( p13.33 -p11.1), Z值為20.81,起 始位置為chr12:200000 - 34499999 ,片段大小為34.3 Mb,代表12號染色體短臂部分三體,見圖1,需行進 一步的有創性診斷確診?
1. 2 胎兒羊水細胞染色體核型分析 經產科醫生咨 詢,簽署知情同意書后,于孕24周時行羊水穿刺?抽 取羊水30 mL,取10 mL用于高通量測序,其余20 mL分2管,以2 000r /min離心10min后棄上清,取 沉淀細胞,加適量羊水細胞培養基,接種于無菌培養 瓶內,置于37℃?含5%二氧化碳的培養箱中靜置培 養8~9d,常規收獲制片?以G顯帶染色制備染色體 標本,對每例標本均按照《人類細胞遺傳學國際命名體制(2013)》標準,計數20個中期分裂相細胞,分析5 個核型?胎兒羊水細胞染色體核型分析結果:47, XX,+i(12)( p10)[58]/46,XX[42],說明該標本為12 號染色體短臂等臂染色體的嵌合體,見圖2?
1. 3 胎兒羊水高通量染色體拷貝數變異檢測(CNV- seq) 提取羊水基因組 DNA,進行文庫構建:通過片 段化-連接?PCR前純化?PCR擴增?PCR后純化等過 程,采用 NextSeq CN500高通量測序儀(貝瑞基因公司),進行 CNV-seq,測序結果經貝瑞基因公司Enli - ven? 變異注釋系統標注?CNV-seq結果為:dup(12) ( p13.33 -p11.1)(mos),提示該標本12號染色體 p13. 33 -p11.1處檢測到拷貝數為3.5,片段大小為 34.70 Mb 的嵌合重復區域,起始位置為 chr12:160001 - 34860000,見圖3? 4?經查閱數據庫[包括 Deci pher 數據庫?在線孟德爾遺傳數據庫 (OMIM)? PubMed數據庫及 UCSC Genome Browser數據庫],得出該標本的變異包含了 PKS的全部區域,結合羊 水細胞染色體核型分析與 CNV-se q的結果,該標本 確診為PKS?
1. 4 孕婦及其配偶外周血染色體核型分析 為明確 變異來源,對該孕婦及其配偶進行了外周血染色體核 型分析,夫妻雙方 G顯帶核型結果均未見異常,見圖 5,說明胎兒染色體變異為新發
2 討 論
PKS的細胞遺傳學特點是特定組織中以嵌合體 形式存在的12號染色體短臂等臂染色體,故也稱為 等臂12p綜合征或12p四體綜合征?PKS的嵌合效 應是由于額外染色體上攜帶的基因最終導致顱面部? 心血管?腎臟和其他系統異常?PKS可累及體內所有 器官及系統,其典型臨床表現如下:( 1)特殊面容包括 皮膚色素異常?粗狂面容?眼距寬?高腭弓?前額突出? 短頸等;( 2)神經系統異常包括腦結構異常?癲癇?肌 張力減退;( 3)心臟缺陷包括心房和室間隔缺損;( 4) 胸部受累包括肺發育不全?膈疝;( 5)胃腸道表現包括 腸旋轉不良及肛門移位;( 6)骨骼肌肉系統發育異常 包括PKS特有的生長模式,即在宮內提示明顯的生 長過度現象,但在出生后立即表現為生長發育遲緩; ( 7)75%的 PKS患兒還有一定程度的視力損傷[ 2 -3]? PKS胎兒在妊娠中期超聲檢查中可顯示出明顯的異 常,包括羊水過多?膈疝?中樞神經系統異常?胎兒水 腫?顏面部異常?心室擴張?短肢畸形等?當超聲檢查 提示羊水過多?膈疝?肢根骨短小,尤其伴有生長過度 時,應首先考慮PKS[ 4]?本研究中該孕婦妊娠中期超 聲檢查提示:胎兒先天性膈疝,股骨?肱骨低于 M-2SD 線,心臟移位至右側胸腔,肺動脈主動脈比值增大,心 包積液,三尖瓣反流(少量)?符合PKS超聲檢查的 主要特征? PKS具有特殊的細胞遺傳學特點,即異常的染色 體有組織特異性,通常在皮膚成纖維細胞中可以檢測 到異常?因此,由于嵌合體的組織特異性,PKS的診 斷可能經常被遺漏,并且通常在快速分裂的細胞,如 外周血淋巴細胞中不能檢測到[ 5 -6]?已報道的病例中 均未在外周血淋巴細胞中診斷出異常染色體i(12) ( p10) [ 7]?據不同組織中期染色體核型分析統計,包 含有異常染色體i(12)( p10)的組織包括:淋巴細胞 (檢出率為0%~2%)?成纖維細胞(檢出率為50%~ 100%)?羊水細胞和骨髓細胞(檢出率均為100%) [ 8]? 皮膚成纖維細胞中檢測嵌合體的成功率高于外周血, 因為其異常細胞的損耗率低于 T淋巴細胞[ 9]?本病 例羊水細胞中i(12)( p10)檢出率為58%,說明CNV - seq技術可以精準地檢測出比例高于5%的嵌合體,也 證明了在PKS的診斷方面,羊水細胞的檢出率較高?
羊水CNV-se q結果顯示,12號染色體短臂重復,其拷 貝數為3.5?一般來說,單純的染色體重復檢測到的拷 貝數應為3,但該標本是12號染色體短臂等臂四倍體 的嵌合體,所以導致其拷貝數為3.5?目前,診斷PKS 的方法主要為細胞遺傳學及分子遺傳學兩類,本病例 采用的細胞遺傳學技術為染色體核型分析,其是染色 體檢查的“金標準”;但由于 PKS特殊的細胞遺傳學 特點,在不同組織中的檢出率有很大差別,所以染色 體核型分析技術對PKS的檢出率并不高?本病例采 用的分子遺傳學技術為CNV-se q,其不針對特定區域 設計探針,而是進行全基因組測序,覆蓋了23對染色 體,精確度高,可檢測到相對分子質量為100×10 3 以 上的染色體變異,并具有很好的重復性與擬合度,與 芯片技術比較,具有成本低?通量高?覆蓋范圍廣及穩 定性更高等優點? PKS屬于染色體微缺失綜合征的一種?染色體 的微缺失或微重復都屬于染色體的拷貝數變異,可引 起微缺失或微重復綜合征,導致患兒身體出現不同程 度器官功能異常?生長發育遲緩或智力損傷等[10]?有 研究顯示,有1.65%的孕婦在產前診斷中可檢出有臨 床意義的染色體微缺失或微重復[11]?要想有效預防 出生缺陷,就需要進行大規模的產前篩查,并對高風 險人群進行產前診斷?NIPT作為高通量測序在臨床 應用最成熟的領域,其檢測胎兒染色體非整倍體異常 已經成為臨床產前篩查的重要部分?2015年國際產 前診斷協會針對 NIPT出臺了最新臨床應用指南,明 確指出 NIPT 可對染色體微缺失或微重復進行檢 測[12]?近年來,隨著測序技術的進一步發展,一些實 驗室引入了染色體微缺失或微重復的無創產前篩查, 作為除了整個染色體非整倍體檢測之外的另一種選 擇,稱之為擴展性的無創產前篩查技術[13]?擴展病種 的無創性產前檢測,篩查的范圍擴大到全染色體基因 組7Mb的片段變異和常見的微缺失或微重復[14],但 目前并沒有充足的臨床應用反饋數據?本研究中采 用 NIPT篩查出胎兒12號染色體短臂重復片段大小 為34.3Mb,并通過CNV-se q證實與胎兒有創產前診 斷結果相符,證明了 NIPT對檢測染色體大片段的重 復有較高的靈敏度和特異度?
綜上所述,PKS是一種散發的罕見染色體疾病,具有復雜的臨床表現及特殊的遺傳學特征,臨床上往 往容易漏診,所以準確有效的產前診斷是避免缺陷患 兒出生,減輕患兒家庭和社會負擔的最佳手段?臨床 上,在產前發現羊水過多?先天性膈疝?過度發育的胎 兒時應該高度警惕,同時建議孕婦完善產前診斷?此 外,隨著 NIPT技術的飛速發展,相信其在產前檢測 領域將會做出更大的貢獻?
參考文獻略?