無血清的細胞培養

實驗概要

    經歷了天然培養基、合成培養基后，無血清培養基和無血清培養成為當今細胞培養領域的一大趨勢。采用無血清培養可降低生產成本，簡化分離純化步驟，避免病毒污染造成的危害。

實驗原理

    無血清培養基(serum free  medium,SFM):是不需要添加血清就可以維持細胞在體外較長時間生長繁殖的合成培養基。但是它們可能包含個別蛋白或大量蛋白組分。雖然基礎培養基加少量血清所配制的完全培養基可以滿足大部分細胞培養的要求，但對有些實驗卻不適合，如觀察一種生長因子對某種細胞的作用，這時需要排除其他生長因子的干擾作用。而血清中可能含有各種生長因子；又如需要測定某種細胞在培養過程中分泌某種物質（抗體、生長因子）的能力；或者要大規模的培養某種細胞，以獲得它們的分泌產物。因此研制出無血清培養基一直是生物科學工作者努力的目標。

主要試劑

無血清培養基的基本配方:基本成分為基礎培養基及添加組分兩大部分。

    用于生物制藥和疫苗生產的細胞在體外培養時，多數呈貼壁生長或兼性貼壁生長；而當其在無血清、無蛋白培養基中生長時，由于缺乏血清中的各種粘附貼壁因子如纖粘連蛋白、層粘連蛋白、膠原、玻表粘連蛋白，細胞往往以懸浮形式生長。

添加組分包括以下幾大類物質

(1）促貼壁物質：許多細胞必須貼壁才能生長，這種情況下無血清培養基中一定要添加促貼壁和擴展因子，一般為細胞外基質，如纖連蛋白、層粘連蛋白等。它們還是重要的分裂素以及維持正常細胞功能的分化因子，對許多細胞的繁殖和分化，起著重要作用。纖連蛋白主要促進來自中胚層細胞的貼壁與分化，這些細胞包括成纖維細胞、肉瘤細胞、粒細胞、腎上皮細胞、腎上腺皮質細胞、CHO細胞、成肌細胞等。

(2）促生長因子及激素：針對不同細胞添加不同的生長因子。激素也是刺激細胞生長、維持細胞功能的重要物質，有些激素是許多細胞必不可少的，如胰島素。

(3）酶抑制劑：培養貼壁生長的細胞，需要用胰酶消化傳代，在無血清培養基中必不可少須含酶抑制劑，以終止酶的消化作用，達到保護細胞的目的。最常用的是大豆胰酶；抑制劑。

(4）結合蛋白和轉運蛋白：常見如轉鐵蛋白和牛血清白蛋白。牛血清白蛋白的添加比較大，可增加培養基的粘度，保護細胞免受機械損傷。許多旋轉式培養的無血清培養基都含有牛血清白蛋白。

(5)微量元素：硒是最常見的。

實驗步驟

一、使用方法:
      目前，血清仍是動物細胞培養中最基本的的添加物，尤其是在原代培養或者細胞生長狀況不良時，常常會先使用有血清的培養液進行培養，待細胞生長旺盛以后，再換成無血清培養液。細胞轉入無血清培養基培養要有一個適應過程，一般要逐步降低血清濃度，從10%減少到5%，3%，1%，直至無血清培養。在降低過程中要注意觀察細胞形態是否發生變化，是否有部分細胞死亡，存活細胞是否還保持原有的功能和生物學特性等。在實驗后這些細胞一般不再繼續保留，很少有細胞能夠長期培養于無血清培養基而不發生改變的。細胞轉入無血清培養之前，要留有種子細胞，種子細胞按常規培養于含血清的培養基中，以保證細胞的特性不發生變化。
為了使細胞適應無血清培養，關鍵的是使所培養細胞：

●處于對數生長中期

●>90% 活細胞率

●適應時以較高的起始細胞接種

有兩種方法使細胞適應無血清培養基（SFM）:

1. 直接適應——細胞從添加血清的培養基轉換到無血清培養基（SFM）中。

     一些類型細胞可直接從包含血清的培養基適應無血清培養基。對于直接適應，接種細胞密度應該:2.5×105~3.5×105細胞/ml。當細胞密度達到1×106~3×106細胞/ml時，傳代培養細胞。當細胞密度在培養4到7天后達到2×106~4×106細胞/ml時，細胞完全適應了無血清培養基。每隔3~5天，當細胞密度達到1×106~3×106細胞/ml，細胞活率在90％時，貯備的適應了無血清培養基的細胞培養物應該再次傳代培養。

2. 連續適應——分好幾步把細胞從添加血清的培養基轉換到無血清培養基（SFM）中，與直接適應相比較，連續適應趨向對于細胞更加溫和一些。

●以2倍正常接種密度接種生長活躍的細胞培養物到75%有血清培養基：25％SFM 混合培養基中，傳代培養。

●當細胞密度>5×105細胞/ml時，以2×105到3×105細胞/ml細胞密度，在有血清培養基：SFM為50∶50的混合培養基中傳代培養。

●以2×106到3×106細胞/ml細胞密度，25％有血清培養基和75% SFM中傳代培養。

●當細胞密度達到1×106到3×106細胞/ml（接種后4到6天），在100％SFM培養基中傳代培養。

●每隔3到5天，當細胞密度達到1×106到3×106細胞/ml，細胞活率在90％時，貯備的適應了無血清培養基的細胞培養物應該再次傳代培養。

     建議備份前一次混合培養的培養物，直到每一次細胞適應了新的混合培養基。每一次減少血清前，可能需要在SFM/有血清混合培養基中進行幾次傳代。在適應過程中，最好不要讓細胞生長過度。這將增加選擇亞群的可能性。需要注意，與有血清培養基相比，大部分SFM包含非常少的蛋白質，因而更易于受外界因素的影響。細胞培養適應替代血清：許多細胞利用連續適應方法能很好的適應，用包含FBS的的培養基和包含有替代血清的培養基1∶1（v∶v）的混合培養基培養細胞。通過下列的混合培養基的方式，連續幾代減少當前培養基的量：1∶2，1∶4，1∶16和100％替代培養基。每次適應改變血清比例時，傳代細胞2到3次。培養可以直接從FBS轉換到替代血清。一開始就使用相同于FBS的濃度的替代物或血清，生長的延遲可能會發生，4允許進行2到3次的傳代，使生長率恢復到以前的水平。特別需要強調的是：配制無血清培養液必須使用高質量的水，如石英玻璃蒸餾器經三次蒸餾或超純水凈化裝置制備的水。因為無血清培養基缺乏了血清中天然成分中和毒素、保護細胞的大分子，既便水中的有毒物質含量甚微，也可能對細胞產生致死性損害。這是無血清培養能否成功的關鍵因素之一。

二、使用無血清培養基的優點

●增加確定性

●性能更加一致

●容易進行純化和下游加工

●細胞功能的精確評估

●增強生長和/或產量

●生理反應性的較好對照

●增強細胞內中介物的檢測