腦損傷的組織學評估
在一些實驗中，成像結果通過腦組織的組織學平估來確定。成像后，動物被灌注肝素化鹽水和10%的福爾馬林，然后使用Vibrotome切片，切成25μm厚的斷片。鄰近的部分都使用蘇木精和曙紅進行組織化學染色，來鑒定受損區域，或者使用異硫氰酸熒光素（FITC）（1:100；30min）鑒別腦血管，以及4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）(1
mg/mL; 1 min)進行細胞核染色。H&E-染色的部分使用LCM PixCell
IIe顯微鏡觀察并記錄相位對比。血腦屏障使用Axiovert 200熒光顯微鏡(Carl Zeiss, Maple Grove,
MN)肉眼觀察cy5.5從大腦薄壁組織溢出，使用近紅外模式（660到680nm激發濾光片和一個700nm的縱向發射濾光片）。成像過程使用AxioVision
LE Rel 4.4軟件。
統計分析
數據顯示為±SD熒光強度或熒光的濃度。缺血性和對側的ROI的統計分析的差異使用單向方差分析，隨后通過多樣本重復比較或雙尾配對樣本t檢驗說明。p值小于0.05被認為差異顯著。
結果
短暫的MCAO后Cy5.5體內成像對比度增強
近紅外染料Cy5.5不會穿過完整的血腦屏障體外(數據未顯示)或體內(通過實驗證實，見圖6B)。在循環中染料迅速消除，主要是通過腎臟排泄。已知過渡態的MCAO可以產生BBB，小分子的釓和大分子的白蛋白，分別使用Cy5.5和BSA-Cy5.5為光學標記物，基于示蹤組織溢出來定位局部缺血性中風。類似的原理應用于核磁共振成像技術，使用釓增強成像效果。在最初的一系列實驗中，60分鐘MCAO后，緊接著進行24小時再灌注，因為它會產生可再生的梗塞，影響很大一部分側紋狀體和顱側區皮層，也會緩和血腦屏障的大分子中斷。實驗方法見圖1A。經過最后的60分鐘的MCAO測量所有動物的重新缺血性值，結果統一的減少局部腦血流量產國缺血性區域低于20%。之后重復缺血值rCBF迅速恢復為大約70%，而且在重復灌注時可以保持這個值大約一小時以上（數據位顯示）。rCBF值測量值證明實驗組的最小變異值（數據未顯示）和已報道的同樣的缺血性模式的數據相似。成像前Cy5.5靜脈內注射15分鐘，隨后在半球形的ROIs獲得兩個成像參數FI和Conc并進行分析（圖1
B-D）。FI信號變現出明顯的大腦左側（缺血性）偏側性（見圖1B）；在六個單獨的動物的大腦半球缺血的FI平均值為3,580 ± 50
AU，對側半球為730 ± 35 AU（(p < .01; t-test; each ROI =150
points)；右大腦半球FI值與重新缺血的基線水平相似 (700±25 AU)，在注入Cy5.5的模擬動物中的測量值為 (740±30
AU)。這一結論證實大部分Cy5.5在注入15分鐘后在循環中消失。
與其他成像技術不同，時域光學技術可以給出熒光基團的深度和濃度信息，可以進行3D重建和斷層成像。三維影像圖分別顯示有x軸，y軸好z軸的頭部位置（見圖1C），1毫米厚度的光切面見圖1D，在缺血新半球深度為6到9毫米（從大腦側面頂部測量）時Cy5.5的濃度值最大（圖1D）。8-9毫米的光學切片（圖1D放大圖像）缺血性區域三維掃描點的Cy5.5的濃度測量值要比對側的高10倍。
圖1：動物經過短暫的60分鐘MCAO，緊接著進行24小時再灌注并注入Cy5.5（100nmol，成像前15分鐘）的頭部ROI區域的體內成像圖。使用eXplore Optix時域臨床前成像儀。A：本實驗試驗方法圖。B：缺血/再灌注前后（I/R）頭部ROI熒光強度（FI）的代表圖像。C：頭部濃度體積測定面重建（分三部分顯示，X軸、Y軸和Z軸），在動物頭部側面有3D斷層成像。D：Z軸部分（201mm切片）通過頭部厚度。頭部頂端側面8—9毫米深度部分的信號最強。是6個動物最具代表性的實驗結果。
Cy5.5溢出的組織學確認
梗塞形成的范圍由60分鐘MCAO及隨后的24小時在灌注在TTC染色腦切片厚度的評價。通過H&E染色進行神經元損害的組織學確認，使用Farber和他的同事們研究的標準，Cy5.5溢出通過熒光顯微法評價。在熒光顯微鏡下大腦部分大致相當于腦區在厚腦切片中描述。如圖2B顯示，缺血性半球的切片相當于圖2A中1,2,3的厚度，表明有典型的神經元壞死，而部分對應厚片4(見圖2)出現了類似的側大腦半球。
鄰近部位的復染劑使用導管結合凝集素（綠色）（圖2C），cy5.5（紅色信號）溢出到大腦薄壁組織擴大到缺血性區域相當于厚片1到3，但是與厚片4不同（圖2，A和C）。有趣的是，一些Cy5.5薄壁組織外溢始終觀察到對側半球的切片相當于厚片1（圖2C1，白色箭頭），甚至在沒有組織學證據的神經損傷。血管內殘留的Cy5.5熒光，主要在缺血性部位觀測到，可能是由于不良的缺血性血管的灌注。
圖2：A，經過60分鐘大腦中動脈閉塞（MCAO）后24小時大腦切面TTC染色的代表性圖像。缺血和腦切片（1-4）對側25mm部分的組織學（B）和熒光顯微鏡（C）分析結果，過程見材料和方法部分。使用FITC-番茄血凝素（綠色）和4',6-二脒基-2-苯基吲哚（藍色）使大腦血管形象化。Cy5.5溢出的信號（紅色）在對側采用箭頭顯示。比例尺=10μm。是6個動物最具代表性的實驗結果。