時間分辨熒光免疫分析在乙肝病毒血清學標志物檢測應用

乙肝病毒 (Hepatits B veius HBV) 感染是我國最常見的感染性疾病之一，而應用免疫技術測定 HBV 特異性抗原抗體是 HBV 感染診斷的主要手段。由于免疫學技術的不斷發展，抗原抗體檢測靈敏度明顯提高，使低水平 HBV 感染得以檢出，對臨床診斷及流行病學有重要意義 [1] 。另外，由于可進行定量分析，這對藥物療效觀察和病情監測具有重要意義 [2] 。時間分辨熒光免疫分析技術 (time resolved fluorecence immunanssay TRFIA) 是一個靈敏度高、特異性強的新的免疫檢測技術，本文應用這一技術對來我院就診的 HBV 感染者及正常人進行了檢測，并與 Axsym 微粒子酶免分析法 (MEIA) 進行了方法學比較，其結果如下：

一、材料與方法
1、標本來源 :
（ 1 ） 正常人血清：取自我院體檢正常人群 180 份。
（ 2 ） 乙型肝炎患者血清：取自我院住院及門診患者 46 份。
（ 3 ） 質控血清：
①衛生部臨檢中心質控血清（批號為 0207 ）濃度分別為： 0.2ng,0.5ng,1.0ng,5.0ng
②北京市臨檢中心質控血清（批號為 0209 ）濃度分別為： 2.0ng,5.0ng

2、方法和試劑 :
（ 1 ） 參照方法：微粒子酶免分析法 (MEIA) 采用 Axsym 全自動免疫分析儀及配套試劑，為美國 Abbott 公司產品，試劑批號為 HBsAg 91046LU00. HBsAb 89348LU01. HBeAg 88314HP00. HBeAb 84053HP00. HBcAb 88058LU00.
（ 2 ）測試方法：時間分辨免疫熒光分析法 (TRFIA) 采用 AT-2000 時間分辨熒光免疫分析儀及配套試劑，為上海新波生物技術有限公司產品。試劑批號乙肝兩對半均為 20020726.

二、結果與分析：
1、HBsAg
   TRFIA cut off 值 HBsAg 濃度≥ 0.5ng/ml 為陽性，
   MEIA cut off 值 HBsAg 濃度 S/N>2.0 為陽性，其二法定性結果見表１

表 1 TR-FIA 和 MEIA 檢測定性結果四格表

靈敏度 46/(0+46)*100%=100%
特異性 46/(46+0)*100%=100%
診斷符合率 100%

　　使用 TRFIA 方法對本地區 180 例正常人進行 HbsAg 測定，結果呈正態分布 : 均值 0.12. 標準差 0.062 。該調查結果符合中國藥品生物制品檢驗所規定最低檢出量 0.5ng/ml 。并與 Abbott 公司配套肝炎診斷方法（ MEIA ）比較，相關系數為 0.833, 具有較好相關，該法檢測靈敏度為 0.36ng/ml 。衛生部臨檢中心 1ng/ml 質控血清對照 : 均值 1ng/ml. 標準差 0.15. 變異系數 15% 。

　　ELISA 方法及金標法檢測靈敏度分別為 0.5ng/ml 和 5ng/ml 。提示該法與 MEIA 的靈敏度相似，能檢測到低濃度之 HBsAg, 初步解決了隱源性肝炎中 HBV 標志檢測的問題。 [1]

2、HBsAb
   TRFIA cut off 值的 HBsAb 濃度≥ 10mIU/ml 時為陽性，
   MEIA cut off 值的 HBsAb 濃度 >10mIU/ml 時為陽性，其二法定性結果見表 2

表 2 TRFIA 和 MEIA 檢測抗 HBs 定性結果四格表

靈敏度 22/(22+0)*100%=100%
特異性 64/(6+64)*100%=91%
診斷符合率 91%

3、HBeAg ：
   TRFIA cut off 值 HBeAg 的濃度 >0.03NCU/ml 為陽性 ,
   MEIA cut off 值 HBeAg 的濃度 S/CO>1.0 為陽性 , 其二法定 性結果見表 3

表 3 TRFIA 和 MEIA 檢測 HBeAg 定性結果四格表

靈敏度 30/(30+0)*100%=100%
特異性 58/(0+58)*100%=100%
診斷符合率 97.7%

4、HBeAb ：
   TRFIA cut off 值 HBeAb>1.5NCU/ml 為陽性，
   MEIA cut off 值 HBe Ab S/N<1.0 ，其二法定性結果見表 4

表 4 TRFIA 和 MEIA 檢測 HBeAg 的定性結果四格表

靈敏度 22/(22+0)*100%=100%
特異性 60/(8+60)*100%=88%
診斷符合率 91%

5、HBcAb ：
   TRFIA cut off 值 HBcAb>0.1NCU/ml 為陽性 ,
   MEIA cutoff 值 HBcAb S/N<1.0 為陽性 , 其二法定性結果見表 5 。

表 5 TRFIA 和 MEIA 檢測 HBcAb 定性結果四格表

靈敏度 60/(60+2)*100%=96%
特異性 24/(2+24)*100%=92%
診斷符合率 95.5%

HbcAb 抗體均按 1 ： 30 倍稀釋后，檢測基本符合感染后的血清學標志物模式。

三、討論 :
　　AXSYM 免疫分析儀微粒子酶免分析法 (MEIA) 檢測 HBV 感染血清學標志物是公認的診斷 HBV 感染的方法。特點是：全自動，操作時環境不易被污染，但成本較高。目前國內檢測 HBV 感染血清學標志物應用較多的仍是 ELISA 方法。其有以下缺點： 1. 無法定量； 2. 靈敏度低； 3. 由檢測原理帶來的前帶現象無法解決； 4. 易污染，無法完成 HBV 感染的動態觀察以及低水平 HBV 感染指標檢測。免疫膠體金檢測技術可大大縮短檢測時間，不需要特殊設備，操作簡單，但靈敏度欠佳，假陽性問題難以克服。

　　用 TRFIA 法做了 46 例乙型肝炎患者血清學標志物，其結果同時與 MEIA 法進行比較符合率分別為 HBsAg 100%,HBsAb 93.02%,HBeAg 97.75%,HBeAb 90.25%,HBcAb 91.67% 。

　　時間分辨免疫分析技術 (TRFIA) 是近年發展起來的無環境污染的高靈敏度免疫標記檢測技術，因稀土離子本身激發光譜寬熒光發射光譜窄，使這一精密檢測技術在普通實驗室能夠進行。它以稀土離子為標記物，通過時間延遲，去除非特異性熒光干擾，在固定時間檢測特異性熒光，解決了自然背景干擾問題，明顯提高檢測靈敏度。并通過激發光與發射光之間較大的 STOKES 位移，明顯排除非特異性熒光的干擾，提高了光譜的分辨率，使特異性明顯增強。它與目前所使用的 HBV 感染標志物檢測方法比較，是一種新的檢測方法，靈敏度高、穩定性好、經濟實用、符合國情。