時間分辨熒光免疫TrFIA分析（以血清中T3和T4檢測為例）

時間分辨熒光免疫分析（time resolved luoro-immunoassay，TrFIA）技術出現于20世紀80年代初期，是在免疫熒光分析的基礎上發展的一種新型超微量物質免疫分析方法。 TrFIA采用鑭系稀土元素標記抗體，利用熒光發射體的熒光壽命差別將波長相同的熒光分開，排除樣品中的非特異熒光的干擾，從而最大限度地提高分析方法的靈敏度。該方法在靈敏度、特異性、穩定性及測量自動化等方面可與放射免疫分析（RIA）相媲美，最小檢出值可達10^-8mol/L，且無放射性污染。

【基本原理】

    鑭系稀土元素銪（Eu³⁺）、釤（Sm³⁺）等通過具有雙功能集團的螯合劑，容易與抗體分子以共軛雙鍵結合制成標記物。當標記抗體和抗原結合后，稀土元素螯合物在紫外光（340nm）激發下，不僅發射出高強度的熒光（613nm），而且衰變時間較長（10ms-1ms），而待測樣品中各種蛋白熒光和其他化合物的非特異熒光的衰變時間一般在1ns-10ns，最長不超過20ns。利用延緩測量時間，待樣品中的非特異的、短命熒光全部衰變后，再測量稀土元素螯合物的特異熒光，就可以完全排除非特異本地熒光的干擾。

【試劑及材料】

（1）分析緩沖液：0.1mol/L，pH7.5 Tris-HCl緩沖液，其中含0.3mol/L三氯醋酸鈉，0.1%BSA，0.02%NaN₃；

（2）洗滌液：生理鹽水，含0.1%Tween-20；

（3）熒光增強液：b-萘酰三氟丙酮6mg，三辛基磷化氫的氧化物19.33g，鄰苯二甲酸氫甲1.3g，冰醋酸6ml，Tween-20 0.2ml， 加三蒸水至500ml， 再加Triton-100 1ml，置37℃水浴至溶解后，補加三蒸水至1000ml，于塑料瓶內保存備用。

（4）T₃和T₄的標準物；

（5）LKB ARCUS-1230時間分辨熒光儀（Pharmacia）；

（6）Eu³⁺標記的Tg（Eu-Tg）：標記方法見附注；

（7）0.1mol/L，pH9.6碳酸鹽緩沖液

【操作方法】

（1）用0.1mol/L，pH9.6碳酸鹽緩沖液將T₃和T₄抗體稀釋到10mg/ml，加入12孔聚苯乙烯滴定條孔中，每孔100ml，室溫放置20h；

（2）甩棄包被液，用洗滌液洗3次；

（3）分別加入不同稀釋度的T₃和T₄的標準物及待檢血清，每孔20ml；

（4）迅速加入100ml 用分析液稀釋的Eu-Tg，微量板震蕩器上混勻；

（5）室溫2h，洗滌液洗滌10次；

（6）每孔加入100ml熒光增強液，慢慢振動5min后，室溫靜止30min；

（7）用LKB ARCUS-1230時間分辨熒光儀測定熒光強度。

【結果分析】

    以不同稀釋度的T₃和T₄的標準物為橫坐標，以相應的熒光強度為縱坐標繪制標準曲線，從標準曲線上就可確定地得知樣品中待測樣品中T₃和T₄的相應含量。

【附注】Tg 的Eu³⁺標記技術

①將1mgTg和1mgcDTPA溶于0.5mol/L，pH8.2碳酸鹽緩沖液中，室溫反應10min；

②用1mol/L NaHCO₃調至pH9.0；

③用飽和硫酸銨沉淀；

④沉淀用0.5ml 1.2mmol/L EuCl3溶液(0.1mol/L，pH6.0檸檬酸緩沖液配制)反應40min；

⑤用Sephadex G-50柱層析分離，即得Eu-Tg。