實驗概要
本實驗構建了昆蟲病原線蟲全長的cDNA文庫，構建的cDNA文庫分別與誘導和未誘導的處理下提取的 mRNA 制備的探針進行雜交，獲得差異表達的基因。
主要試劑
1. 酶類及分子量標準
1) 高保真酶Easy-A high fidelity cloning enzyme,Merck公司Stratagene系列；
2) Taq DNA Polymerase，上海申能博彩生物技術有限公司；
3) DL 2000 DNA Marker，寶生物工程（大連）有限公司。
2. 主要試劑（盒）
1) TOPO TA Cloning Kit for Sequencing，美國Invitrogen公司；
2) TaKaRa Random Primer DNA Labeling Kit Ver. 2.0，TaKaRa 公司；
3) [α－P32] dCTP（3μCi/pmol），北京福瑞生物工程公司；
4) dNTP，上海申能博彩生物技術有限公司；
5) 雜交液，北京鼎國生物技術有限責任公司；
6) 瓊脂糖（Agarose），進口分裝，上海Yito公司；
7) 胰蛋白胨（bacto-tryptone）、酵母浸出粉（bacto-yeast extract），英國OXOID公司。
8) 瓊脂粉，廣東環凱微生物科技公司；
9) 卡那霉素（kanamycin），美國Sigma公司；
10) 注射用硫酸鏈霉素，山東魯杭醫藥有限公司；
11) 溴化乙錠（ethidium bromide，EB），華美生物工程公司；
12) 其他試劑為國產分析純。
3. 主要溶液
1) 溴化乙錠（EB）溶液（10 mg/mL）：稱取EB約300 mg于試劑瓶中，加入雙蒸水30 mL，充分混勻，4℃備用。
2) 卡那霉素儲存液（50 mg/mL）：稱取卡那霉素1 g，溶于20 mL水中，充分混勻，過濾除菌，分裝貯存于-20℃。
3) 50×TAE電泳緩沖液
Tris 242 g
EDTA (0.5 mol/L，pH 8.0) 100 mL
冰乙酸 57.1 mL
加水定容至1000 mL
4) 20×SSC溶液：稱取88.23 g二水檸檬酸鈉，175.32 g NaCl，溶解于800 mL雙蒸水中，用10 M NaOH調PH至7.0，定容至1 L。高壓滅菌15 min，室溫保存。
5) 洗膜液I 〔2×SSC，0.1％（W/V）SDS〕：于800 mL雙蒸水中，加入100 mL 20×SSC，10 mL 10％SDS，定容至1 L，室溫保存。
6) 洗膜液II 〔1×SSC，0.1％（W/V）SDS〕：于800 mL雙蒸水中，加入50 mL 20×SSC，10 mL 10％SDS，定容至1 L，室溫保存。
7) 洗膜液III 〔0.1×SSC，0.1％（W/V）SDS〕：于800 mL雙蒸水中，加入5 mL 20×SSC，10 mL 10％SDS，定容至1 L，室溫保存。
4. 培養基
1) LB培養基
Tryptone 10 g
Yeast Extract 5 g
NaCl 10 g
pH 7.2
加水至1000 mL（固體培養基加1.8％瓊脂粉）
2) LB抗性篩選培養基
待滅菌后的LB固體培養基溫度降至50℃左右，加入抗生素儲存液卡那霉素（50 mg/mL）或羧芐青霉素（100 mg/mL）至終濃度50 μg/mL，即每毫升培養基加抗生素儲存液1 μL，搖勻后，倒平板。
液體LB抗性篩選培養基，在完全冷卻后加入抗生素，加入的量與固體培養基相同。
3) SOC液體培養基
Tryptone 20 g
Yeast Extract 5 g
NaCl 0.5 g
加入950 mL水，完全溶解后加入250 mmol/L的KCl溶液10 mL，用NaOH溶液（5 mmol/L）調節pH值至7.0，雙蒸水定容至1000 mL后高壓滅菌。滅菌后降溫至60℃以下，加入7.2 mL 50％葡萄糖溶液。使用前加入5 mL經滅菌的2 mol/L的MgCl2溶液。
主要設備
1. MDF-192型超低溫冰箱，日本三洋電機株式會社；
2. CF43S超凈工作臺，Gelman公司；
3. 高速冷凍臺式離心機，Heraeus Sepatech公司；
4. Capsule HF-120型微量離心裝置，Millipore公司；
5. BL150S型電子天平，德國Sartorius公司；
6. GB 1302型天平，Mettler-Toledo儀器（上海）有限公司
7. C-90-1型電熱恒溫水浴鍋，廣州市越秀區醫療器械廠；
8. 微波爐，日本Sharp；
9. YXQ.WY21-600IIR臥式高壓蒸汽消毒器，廣州市醫療設備廠；
10. DYCD-31D型水平電泳槽，北京六一儀器廠；
11. EPS1001型電泳電源，Amersham Pharmacia公司；
12. 連續可調微量移液器，德國Eppendorf公司；
13. Primus 25型PCR基因擴增儀，德國MWG公司；
14. AlphaImager 2200型凝膠圖像分析系統，Alpha Innotech公司；
15. XK96-B微型旋渦混合儀，江蘇省姜堰市新康儀器廠；
16. 細菌過濾器（0.2 μm孔徑），美國Pall公司；
17. Model 1000 Hybidization incubator，美國Robbins Scientific公司；
18. 紫外交聯儀Stratagene 1800，廣州英韋創津有限公司；
19. Hybond N＋尼龍膜；Amersham Biosciences公司；
20. Kodak X-OMAT AR膠片；
21. Watteman濾紙；
22. BIO-RAD Molecular Imager FX成像系統。
實驗材料
1. 前期實驗獲得的昆蟲病原線蟲雙鏈cDNA
2. 質粒與菌株
1) 線性克隆載體pCR4-TOPO，美國Invitrogen公司；
2) 大腸桿菌E. coli TOP10，美國Invitrogen公司。
實驗步驟
1. 誘導過的感染期線蟲cDNA文庫的構建
1) PCR產物與載體的體外連接
克隆載體pCR4-TOPO是經過DNA拓撲異構酶（topoisomerase）活化的一種線性T載體，由于DNA拓撲異構酶能夠特異性地解旋DNA超螺旋，同時對DNA特殊序列CCCTT特異性識別，在構建新載體的克隆技術中常被用于對外來目的基因片段的高效連接。經DNA拓撲異構酶活化后的線性DNA載體，在受到外來目的基因片段的“攻擊”后，發生DNA鏈之間的重連反應，經過酶與雙螺旋DNA的非共價結合、單鏈DNA斷裂并與酶形成共價中間產物、單鏈脫離、斷裂鍵的重連等過程后完成目的片段與供載體的連接。與此同時，拓撲異構酶從DNA上脫離。
由于線性載體5’末端帶有T堿基，當使用Easy-A high fidelity cloning enzyme催化PCR反應時，即能保證擴增反應時的保真性，而且擴增產物的3’端會帶有堿基A，這樣可以將純化的PCR產物直接用于與線性載體的連接，而無需傳統的酶切、連接手段，具有省時，高效的優點。連接成功后，環化的克隆載體帶有目的基因。同時，載體上的Kanr基因可用于攜帶目的片段的大腸桿菌重組子陽性克隆的抗性篩選，而復制起始子pUC使其保持在大腸桿菌TOP10中的高拷貝復制。
在潔凈的0.2 mL PCR管中依次加入下列組分：
PCR產物 4 μL
鹽溶液 1 μL
TOPO載體（pCR4-TOPO） 1 μL
總體積 6 μL
輕混反應物，室溫（20℃～23℃）下培養10 min，取2 μL用于隨后的轉化實驗或于-20℃保存備用。
2) 大腸桿菌的轉化
A. 取出一管TOP10感受態細胞50 μL，于冰上緩慢旋轉融化；
B. 加入2 μL待轉化質粒（或不加質粒作陰性對照），輕輕旋轉，將質粒與感受態細胞混合均勻，冰浴30 min；
C. 42℃熱休克30秒，不要搖動離心管；
D. 立即將離心管轉移到冰上，放置5 min，加入250 μL平衡到室溫的無菌SOC培養基；
E. 擰緊瓶蓋，于37℃，200 rpm水平振蕩60 min；
F. 取10 μL～100 μL不同體積的菌液鋪于預熱的選擇性LB平板上，37℃倒置培養過夜；
G. 轉化子培養后，保存于15％甘油中，-80℃凍存。
3) 克隆片斷長度的檢測
從轉化板上挑取轉化子菌落，接種到650 μL LB抗性液體培養基中，37℃，200 rpm，培養過夜。吸取菌培養物作為PCR反應的模板，建立以下反應體系：
ddH2O | 17.35μL | ||
10×PCR buffer | 2.5 μL | ||
dNTP Mix (10 mmol/L) | 0.5 μL | ||
M13-for (1 μmol/L) | 2 μL | ||
M13-rev (1 μmol/L) | 2 μL | ||
DNA template | 0.5μL | ||
Taq DNA Polymerase | 0.15 μL | ||
Total volume | 50 μL |
利用pCR4-TOPO載體測序引物M13進行菌落PCR檢測鑒定插入片斷的長度，篩選大于400bp的克隆進行雜交實驗。
充分混勻，按以下程序進行PCR擴增：95℃熱變性5 min進入循環，94℃變性45秒，55℃退火45秒，72℃延伸1 min，30個循環后于72℃繼續延伸10min。擴增產物以瓊脂糖凝膠電泳檢測，置于-20℃保存備用。
2. 探針模板的合成及探針的制備
1) 第一鏈cDNA探針模板的合成
參照SuperScriptTM II Reverse Transcriptate試劑盒說明書。
A.以提取的對照線蟲的及共生細菌誘導線蟲的總RNA合成探針模板。在1.5 mL離心管（無RNA酶）中，依次加入下述組分建立反應體系：
50ng～250 ng Radom primer | 1 μL | ||
5 μg Total RNA | .5μL/3.6μL | ||
1 μL dNTP Mix (10 mM each) | 1 μL | ||
ddH2O | 6.5μL /6.4μL | ||
Total volume | 12 μL |
B. 65℃溫育5 min，立即到冰上冷卻，微離，收集液體于管底，依次加入如下組分：
5×First-Strand Buffer | 4 μL | ||
0.1 M DTT | 2 uL | ||
RNaseOUTTM(40 units/μL) | 1 μL | ||
Total volume | 7 μL |
C. 充分混勻，室溫放置2 min；
D. 加入1 μL（200 units）SurperscriptTM II RT，吸頭混勻；
E. 42℃溫育50 min；
F. 70℃，15 min終止反應；
G. 加入1 μL（2 units）E.coli RNase H，37℃溫育20 min，以去除RNA；
2) 第一鏈cDNA 探針模板的純化
A. 加入5倍體積的Buffer PB到上述產物中，充分混勻；
B. 取出樣品收集管和吸附柱，將混合物全部轉移到柱中，13000 rpm，離心1 min；
C. 取下吸附柱，棄去收集管中廢液，將吸附柱套回同一支收集管中，吸取 0.75 mL Buffer PE到吸附柱中，高速離心1 min，棄濾過液；
D. 再次高速離心1 min，移走殘留的洗液；
E. 將吸附柱套入干凈的1.5 mL離心管中，在柱膜中央加入30 μL ddH2O，室溫放置1 min，高速離心1 min，洗脫產物于-20℃保存備用。
3) 探針的制備
按照TaKaRa Random Primer DNA Labeling Kit Ver. 2.0說明書的方法。
A. 在0.2 mL PCR管中加入14 μL第一鏈cDNA，2 μL Random Primer，充分混勻；
B. 再依次加入下述組分建立反應體系：
10×Buffer | 2.5 μL | ||
dNTP Mixture(except dCTP) | 2.5 μL | ||
111 TBq/mmol(α－P32 dCTP) | 3 μL | ||
Exo-free Klenow Fragment | 1 μL | ||
Total volume | 25 μL |
C. 37℃反應10 min；
D. 65℃加熱5 min使酶失活；
E. 95℃加熱3 min后迅速置于冰中冷卻；
F. 取適量的反應液直接作為探針使用。
3. 斑點雜交
1) PCR產物變性
在15 μL PCR產物中依次加入43 μL的ddH2O，40 μL 1M的MaOH（終濃度0.4M）和2 μL 0.5M的EDTA（終濃度0.01M），100℃熱變性10 min，之后立即冰浴。
2) 制膜點樣
采用Bio-Dot微過濾系統制膜點樣，裝置的安裝及轉膜操作按說明書進行。
A. 用6×SSC浸潤Hybond-N 尼龍膜10 min；
B. 將膜用濾紙吸掉多余的SSC，置于微過濾裝置上，對角線擰緊旋鈕，打開調節開關，呈真空狀態，并再次對角線旋緊旋鈕；
C. 調節開關使之形成部分真空，各孔分別加入100 μL ddH2O，手動調節開關，形成部分－完全真空，慢慢濾干水；
D. 各孔加入45 μL變性后的DNA樣品，按步驟（3）操作，慢慢濾干樣品；
E. 各孔加入100 μL 2×SSC至各孔，調節開關至完全真空狀態，直至各孔的樣品完全轉移到膜上；
F. 擰松螺旋，移走樣品板，關閉真空泵，取下膜；
G. 在紫外交聯儀（Stratagene 1800）中，DNA交聯固定40秒；
H. 使膜夾于兩層濾紙間，80℃加熱30 min，然后用保鮮膜包好，4℃保存；
I. 清洗、晾干微過濾裝置，同樣的方法平行點另一張膜。
3) 雜交
A. 預雜交：將點好樣的平行膜分別置于雜交管中，各加入5～10 mL雜交液，排盡氣泡，65℃預雜交3 h；
B. 雜交：將標記好的兩種探針25 μL，分別加到雜交液中，65℃雜交過夜。
C. 洗膜：將雜交液倒出，30℃用洗膜液I短暫淋洗；再用雜交液I洗膜10 min，1次；再用雜交液II洗膜10 min，1次；再用雜交液III洗膜5 min，1次；期間，不斷用同位素檢測儀檢測，信號在10～20為佳，立即停止洗膜；
D. 洗完后的膜，用Watteman濾紙吸干膜上的水，保鮮膜包好，待放射自顯影。
4) 放射自顯影
A.將包裹好的尼龍膜置于已消磷的磷屏上，DNA面向著磷屏，室溫放置一定時間（信號在5～10，壓屏2h～3h；信號在20～50，壓屏0.5h～1h；信號大于50，壓屏20 min），將磷屏取出，放于分子磷屏成相系統FX（BIO-RAD）中掃描；
B. 根據信號的強弱，再將尼龍膜轉入暗盒內，DNA面向著感光屏，再壓上X光片（Kodak），置于-80℃，放射自顯影3～7天；
C. 暗室內，先將緊靠感光屏的一張X光片浸入顯影液中，顯影30秒～90秒，期間可以在安全燈下觀察而控制顯影的時間，立即浸入定影液中1 min。同樣方法，顯影另一張X光片。將X光片用水沖洗干凈，晾干。
4. 序列測定及同源性分析
挑取有差異的點的克隆的甘油貯存菌，委托北京三博遠志生物有限公司測序。獲得的序列分別使用BLASTn和BLASTx搜索National Center for Biotechnology Information (NCBI)的核苷酸和蛋白質數據庫，進行序列的相似性分析。匹配性的P值為10－5或更小，我們認為序列之間有較高的相似性，否則認為序列的相似性很低，稱為“low hits”，數據庫中若沒有與其匹配的序列稱為“no hits”。