昆蟲細胞的保存培養實驗

草地夜蛾（Sf 9）細胞                                                          

70％乙醇                                                                  0.4％(m V)臺盼藍                                                          

無血清昆蟲細胞培養基                                                                  60  mm 培養皿或 25  cm2 培養瓶 27℃ 培養箱                                                                  旋轉細胞培養瓶                                                                  多轉瓶的攬拌臺                                                                  離心機                                                                  帶螺口蓋的凍存管                                                                  液氮罐                                                          

1. 將 3 ml 含 10％ 胎牛血清的昆蟲細胞培養基 TNM-FH 加入到一個 60 mm 組織培養皿或 25 cm² 培養瓶中。

2. 取出一支凍存 Sf 9 細胞的安瓿，迅速置于 37℃ 水浴，用手前后搖動融化。當安瓿的內容物幾乎完全融化時，將安瓿浸入 70％ 乙醇，消毒外壁。

3. 打碎安瓿頸部，將內容物轉移至步驟 1 的 60 組織培養皿或 25 cm² 培養瓶。用手輕輕搖動，使細胞分散均勻，置 27℃ 溫育 2～3 h 直到細胞貼壁。

4. 除去舊培養液，換 3 ml 新鮮培養液 TNM-FH/10％FBS，繼續溫育。每 3 天換液一次（除去舊培養液換新鮮的），直到細胞生長匯片（形成擁擠的單層培養物）。

5. 當 Sf 9 細胞已生長匯片時，棄去培養瓶中的培養液。加入新鮮的完全培養液，用移 液管輕柔吹打重懸細胞。

6. 用為培養組織細胞設計的血細胞計數器計數細胞。在血細胞計數器小方格上的每一個細胞相當于 10⁴ 細胞/ml。

7. 在一個新的 60 mm 組織培養皿或 25 cm² 培養瓶中接種來自步驟 5 的（1～2）× 10⁶ 個細胞，搖動培養瓶使細胞均勻分布（如果制備大量培養細胞，可用大的培養瓶，裝入更多的培養液）。加入新鮮培養液 TNM-FH/ 10％ FBS 至終體積 3 ml。

8. 27℃ 溫育，每 3 天用 TNM-FH/10％ FBS 培養基換液，直到培養瓶中的細胞生長匯片。

9. 棄去匯片的單層培養細胞中的培養液，并重懸細胞（同步驟 5），用血細胞計數器計數細胞。

10. 以（4～5）× 10⁵ 細胞/ml 的密度將細胞接種于一個旋轉培養瓶中，27℃ 溫育，以 60～80 r/min 的速度恒速攪拌。輕微開啟旁邊的通氣孔，以保證充足的空氣。

11. 每隔 2 或 3 天進行細胞計數（見附錄 3F）。當細胞密度達到（2～2.5）× 10⁵ /ml 時 進行傳代，將適量細胞移至一個含有新鮮培養液 TNM-FH/10％ FBS 的新培養瓶中，使終密度達到（4～5）× 10⁵/ml。

12. 在 1 ml 對數生長的細胞中加入 0.1 ml 的 0.4％ 臺盼藍，測定細胞活力。在低倍顯 微鏡下檢查細胞，計數被臺盼藍染色的細胞（死細胞）和總細胞數，計算出死細胞和活細胞的百分比例。

13. 將單層培養細胞（從步驟 5）或懸浮培養細胞（從步驟 11）傳代至由 1 份完全 TNM-FH/10％FBS 培養液和 1 份無血清培養液（Bacu 10 Gold，Sf-900 II 或 ExCell 401）組成的混合培養液中。讓細胞長至匯片（單層培養），或達到（2～3）× 10⁶ 細胞/ml 的密度（懸浮培養）。

14. 按步驟 13 的方法重復，將細胞傳代至 TNM-FH/10％FBS 培養液與無血清培養液比例為 1 : 3 的混合培養液中，使細胞生長。

15. 按步驟 13 的方法，用完全培養液與無血清培養液比例為 1: 7 至 1 : 9 的混合培養液，重復細胞傳代與細胞生長的步驟。

16. 用無血清培養液傳代細胞。

17. 計數呈對數生長的待凍存細胞（見附錄 3F）。

18. 室溫以 1000 g（GH-3.7 轉子為 2000r/min）離心 10 min， 棄去上清液。

19. 用 TNM-FH/10％ FBS 培養液以（1～2）× 10⁷ 細胞/ml 的密度重懸細胞團塊。加入等體積含 20％ DMSO 的 TNM-FH/10％ FBS 培養液，將細胞置于冰浴。吸出 1 ml 細胞懸液，移入帶螺口蓋的凍存管中，置于 -20℃ 1 h，然后 -70℃ 過夜。

20. 將凍結的細胞移至液氮罐中以便長期保存。

1. 所有與活細胞接觸的試劑和儀器均應無菌而且應使用相應的無菌操作。

2. 換液時要使培養皿傾斜一個角度，在一個角上移出和加入培養基以避免攪動單層細胞。

3. 細胞在無血清培養液中生長緩慢，需要幾次傳代才能恢復正常的生長速率和活性。

4. 步驟 12 中活細胞的百分比例應大于 97％， 為了保持在懸浮細胞中傳遞足夠的氧氣，必須保持表面積與培養體積成一定的比例。