明膠酶譜實驗

細胞外基質（ECM）是細胞生存的重要內環境，不僅含有膠原、糖蛋白、蛋白多糖等成分，而且含有大量的蛋白酶、細胞因子、黏附分子。ECM，尤其是其中的基底膜，是腫瘤轉移過程中必須克服的生理屏障。基質金屬蛋白酶家族（MMPs）可以降解細胞外基質，幫助腫瘤細胞克服這一屏障

并為細胞增殖提供空間。MMP2、MMP9是主要降解基底膜上IV型膠原和明膠的基質金屬蛋白酶類，與惡性腫瘤浸潤轉移的關系尤為密切，通過蛋白電泳即可檢測MMP2，MMP9的活性。

細胞勻漿組織提取物

聚丙烯酰胺凝膠明膠濃縮膠Tris-甘氨酸緩沖液Triton X-100過硫酸銨甲醇醋酸考馬斯亮藍蛋白質上樣緩沖液

電泳糟pH計凝膠成像儀離心機電泳儀細胞培養瓶倒置顯微鏡超凈臺高壓蒸汽滅菌鍋電子天平液氮罐微型旋轉柱旋轉混合儀

一、主要試劑的配制

1. 平衡緩沖液：50 mmol／L Tris（pH7.5），0.5 mol／L NaCl，10 mmol／L

CaCl₂，0.01％Tween 20，5 mmol／L 鄰二氮菲。

2. 洗滌緩沖液1：50 mol／L Tris（pH7.5），0.5 mmoL／L NaCl，10 mmol／L CaCl₂，0.05％Tween 20，5 mmol／L鄰二氮菲。

3. 洗滌緩沖液2：50 mmol／L Tris（pH7.5），10 mmoL／L CaCl2，0.01％Tween 20，5 mmol／L鄰二氮菲。

4. 8％分離膠（含0.1％明膠）：30％丙烯酰胺2.7 ml，ddH20 4.5 ml，1.5 mol／L Tris（pH 8.8）2.5 ml，10％ SDS 100 μl，10％ 過硫酸銨（APS） 100 μl，TEMED 6 μl。

5. 濃縮膠：ddH20 2.1 ml，30％丙烯酰胺0.5 ml，1 mol／L Tris-HCI（pH6.8）0.38 ml，10％SDS 30 μl，10％過硫酸銨30 μl，TEMED 3 μl。

6. 5×Tris-甘氨酸電泳緩沖液（pH8.3）：0.125 mol／L Tris-HCl，1.25 mol／L甘氨酸，0.5％SDS。

7. 5×上樣緩沖液：30％ 1 mol／L Tris-HCl（pH6.8），25％甘油，0.05％溴酚藍。

8. 洗脫液：2.5％ TritonX-100（去離子水定容）。

9. 孵育液：50 mmoL／L Tris-HCl，10 mmol／L CaCl₂，1％ TritonX-100，

pH7.5，去離子水定容。

10. 染色液：0.25％考馬斯亮藍R-250，45％甲醇，10％乙酸。

11. 脫色液：30％甲醇，10％乙酸。

二、實驗方法

1. 收集生長對數期的癌細胞培養液。

2. 將500μl培養液，45μl明膠瓊脂糖顆粒（使用前混勻）和45μl平衡緩沖液混合均勻后加入微型旋轉柱中，于旋轉混合儀上平衡30min。

3. 用洗滌緩沖液1洗滌瓊脂糖顆粒，每次100μl洗滌3次，7000r/min離心除去洗滌緩沖液1。

4. 用100μl洗滌緩沖液2洗滌瓊脂糖顆粒1次，7000r/min離心除去洗滌緩沖液2。

5. 向微型旋轉柱中加入40μl的2x上樣緩沖液，7000r/min離心。將離心后的上樣緩沖液重新加入微型旋轉柱中，于12000r/min離心10s。

6. 采用8%分離膠在130V恒壓下電泳2.5h。

7. 用洗脫液在搖床上洗滌蛋白膠2次，各30min，除去膠中的SDS。

8. 37℃孵育蛋白膠24h，使MMP分解明膠。

9. 搖床上染色1h及脫色至條帶清晰。

10. 蛋白成像：用凝膠成像儀進行拍照。

1. 制備聚丙烯酰胺時應注意排除氣泡。

2. 明膠酶譜的活性受鈣離子，鋅離子和pH值等因素的影響，因此緩沖液配制應嚴格準確，盡量用超純水，孵育溫度要控制好。

3. 為防止樣品中的酶變性失活，禁忌煮沸蛋白樣品，且上樣緩沖液中不能含β-巰基乙醇或DTT。

4. 孵育液的pH最好在7.5——7.6，復性的Triton放置時間過長會有絮狀物，所以實驗時盡量使用新鮮配置的溶液。

5. 孵育的37℃不要在CO₂培養箱中，因為會改變孵育液的pH值，在普通孵箱即可。

6. 明膠要4℃保存，配好后1周內使用。

來源《腫瘤治療藥物體外模型研究方法》。