明膠酶譜實驗

細胞外基質（ECM）是細胞生存的重要內環境，不僅含有膠原、糖蛋白、蛋白多糖等成分，而且含有大量的蛋白酶、細胞因子、黏附分子。ECM，尤其是其中的基底膜，是腫瘤轉移過程中必須克服的生理屏障。基質金屬蛋白酶家族（MMPs）可以降解細胞外基質，幫助腫瘤細胞克服這一屏障

并為細胞增殖提供空間。MMP2、MMP9是主要降解基底膜上IV型膠原和明膠的基質金屬蛋白酶類，與惡性腫瘤浸潤轉移的關系尤為密切，通過蛋白電泳即可檢測MMP2，MMP9的活性。

細胞勻漿                                                                  組織提取物                                                          

聚丙烯酰胺凝膠                                                                  明膠                                                                  濃縮膠                                                                  Tris-甘氨酸緩沖液                                                                  Triton X-100                                                                  過硫酸銨                                                                  甲醇                                                                  醋酸                                                                  考馬斯亮藍                                                                  蛋白質上樣緩沖液                                                          

電泳糟                                                                  pH計                                                                  凝膠成像儀                                                                  離心機                                                                  電泳儀                                                                  細胞培養瓶                                                                  倒置顯微鏡                                                                  超凈臺                                                                  高壓蒸汽滅菌鍋                                                                  電子天平                                                                  液氮罐                                                                  微型旋轉柱                                                                  旋轉混合儀                                                          

一、主要試劑的配制

1. 平衡緩沖液：50 mmol／L Tris（pH7.5），0.5 mol／L NaCl，10 mmol／L

CaCl₂，0.01％Tween 20，5 mmol／L 鄰二氮菲。

2. 洗滌緩沖液1：50 mol／L Tris（pH7.5），0.5 mmoL／L NaCl，10 mmol／L CaCl₂，0.05％Tween 20，5 mmol／L鄰二氮菲。

3. 洗滌緩沖液2：50 mmol／L Tris（pH7.5），10 mmoL／L CaCl2，0.01％Tween 20，5 mmol／L鄰二氮菲。

4. 8％分離膠（含0.1％明膠）：30％丙烯酰胺2.7 ml，ddH20 4.5 ml，1.5 mol／L Tris（pH 8.8）2.5 ml，10％ SDS 100 μl，10％ 過硫酸銨（APS） 100 μl，TEMED 6 μl。

5. 濃縮膠：ddH20 2.1 ml，30％丙烯酰胺0.5 ml，1 mol／L Tris-HCI（pH6.8）0.38 ml，10％SDS 30 μl，10％過硫酸銨30 μl，TEMED 3 μl。

6. 5×Tris-甘氨酸電泳緩沖液（pH8.3）：0.125 mol／L Tris-HCl，1.25 mol／L甘氨酸，0.5％SDS。

7. 5×上樣緩沖液：30％ 1 mol／L Tris-HCl（pH6.8），25％甘油，0.05％溴酚藍。

8. 洗脫液：2.5％ TritonX-100（去離子水定容）。

9. 孵育液：50 mmoL／L Tris-HCl，10 mmol／L CaCl₂，1％ TritonX-100，

pH7.5，去離子水定容。

10. 染色液：0.25％考馬斯亮藍R-250，45％甲醇，10％乙酸。

11. 脫色液：30％甲醇，10％乙酸。

二、實驗方法

1. 收集生長對數期的癌細胞培養液。

2. 將500μl培養液，45μl明膠瓊脂糖顆粒（使用前混勻）和45μl平衡緩沖液混合均勻后加入微型旋轉柱中，于旋轉混合儀上平衡30min。

3. 用洗滌緩沖液1洗滌瓊脂糖顆粒，每次100μl洗滌3次，7000r/min離心除去洗滌緩沖液1。

4. 用100μl洗滌緩沖液2洗滌瓊脂糖顆粒1次，7000r/min離心除去洗滌緩沖液2。

5. 向微型旋轉柱中加入40μl的2x上樣緩沖液，7000r/min離心。將離心后的上樣緩沖液重新加入微型旋轉柱中，于12000r/min離心10s。

6. 采用8%分離膠在130V恒壓下電泳2.5h。

7. 用洗脫液在搖床上洗滌蛋白膠2次，各30min，除去膠中的SDS。

8. 37℃孵育蛋白膠24h，使MMP分解明膠。

9. 搖床上染色1h及脫色至條帶清晰。

10. 蛋白成像：用凝膠成像儀進行拍照。

1. 制備聚丙烯酰胺時應注意排除氣泡。

2. 明膠酶譜的活性受鈣離子，鋅離子和pH值等因素的影響，因此緩沖液配制應嚴格準確，盡量用超純水，孵育溫度要控制好。

3. 為防止樣品中的酶變性失活，禁忌煮沸蛋白樣品，且上樣緩沖液中不能含β-巰基乙醇或DTT。

4. 孵育液的pH最好在7.5——7.6，復性的Triton放置時間過長會有絮狀物，所以實驗時盡量使用新鮮配置的溶液。

5. 孵育的37℃不要在CO₂培養箱中，因為會改變孵育液的pH值，在普通孵箱即可。

6. 明膠要4℃保存，配好后1周內使用。