明膠酶譜法操作

明膠酶譜法

原理： 

?    酶譜法的基本過程是先將樣品進行SDS-聚丙烯酰胺（SDS-PAGE，含0.1％明膠）電泳分離，然后在有二價金屬離子存在的緩沖系統中使樣品中的MMP-2和MMP-9恢復活性，在各自的遷移位置水解凝膠里的明膠，最后用考馬斯亮藍將凝膠染色，再脫色，在藍色背景下可出現白色條帶，條帶的強弱與MMP-2和MMP-9活性成正比。

復性原理：在電泳過程中，SDS與樣品中的MMPs結合（當然是可逆性結合），破壞其氫鍵、疏水鍵而使MMPs不能發揮其分解明膠的作用，而只有當將膠置Trition中洗脫（最好是放在搖床上搖，30min／次，做2次或15min/次，4次。靜置于Trition中是不妥的。）時，由于SDS被Trition結合而去除，從而使MMPs恢復了活性。

試劑的配制
（1）配制10%SDS聚丙烯酰胺凝膠（含1.0mg/ml 明膠，配好后1周內使用，明膠含量低靈敏度高）
A．分離膠的配制（注：根據你所用的電泳儀膠的大小確定配制膠的量）
10% SDS聚丙烯酰胺凝膠 10ml（包括）
ddH2O                                   4.5ml
30%儲備膠（0.8%BIS+29.2%丙烯酰胺）       2ml
1.5mol/l Tris（PH 8.8）                 2.5ml
10% SDS                                 100ul
10%過硫酸銨（APS）                      100ul
TEMED                                     8ul
1%明膠（1g明膠-->100ml，37°C水浴溶解） 0.5ml

B.濃縮膠的配制
濃縮膠                                    6ml
ddH2O                                   4.5ml
30%儲備膠                              0.75ml
1mol/l Tris-HCL( PH 6.8)               0.76ml
10% SDS                                  60ul
10%過硫酸銨                              60ul
TEMED                                     6ul

（3）5×Tris –甘氨酸電極緩沖液
0.125mol/l Tris-HCL，1.25mol/l 甘氨酸，0.5%SDS（PH 8.3）

（4）4 ×上樣緩沖液
0.32% Tris-HCL 6.4ml
4%SDS（PH7.2） 8ml
16%甘油 3.2 ml
溴酚藍 0.024g
ddH2O 2.4ml
(5) 洗脫液:2.5% Triton X-100，50mmol/L Tris-HCl<6.057g/L> ，5mmol/L CaCl2<0.5549g/L>，pH7. 6   （40分鐘兩次，中間換液）

（6）漂洗液： 50mmol/L Tris-HCl， 5mmol/L CaCl2，pH7. 6 （20分鐘2次）
（7）孵育液：50mmol/LTris,pH7.5,150mmol/LNaCl,10mmol/LCaCl2,0.02%NaN3（孵育42小時）
（8）染色液：0.05% Coomassic 亮藍 R-250，30%甲醇，10%乙酸（染色3小時）
（9）脫色液A、B、C：甲醇濃度分別為30%、20%、10 % ,乙酸濃度分別為10 %、10 %、5% （分別30min、1h、2h脫色）

實驗步驟
1.取對數期的癌細胞在的無血清培養基DMEM中培養24h。
2.次日收集上清液，將上清液移入離心管中 2000rpm 離心10min，-70℃儲存備用。
3.根據細胞計數調整各組細胞培養上清液中的蛋白濃度（或者測定蛋白濃度調整使所上蛋白總量一致）。與5×上樣緩沖液混合，13ul樣本+4ul上樣緩沖液。（不要用槍用力吹打，防止出現過多氣泡）
4.配制分離膠和濃縮膠，16ul/孔上樣（根據表達強度和蛋白濃度確定上樣量），4℃進行SDS-PAGE 電泳100v約1.5小時（電泳時在周圍敷上冰，有利于使條帶跑直）。
5.電泳結束后,將凝膠置于洗脫液(2.5% Triton X-100，50mmol/L Tris -HCl ，5mmol/L CaCl2，pH7. 6) 中振蕩洗脫2次,每次40分鐘,然后用漂洗液(除不含Triton X - 100 外其余同洗脫液) 漂洗2次,每次20分鐘,接著,將凝膠置于孵育液( 50mmol/L Tris - HCl , 5mmol/ CaCl2 , 0. 02% Brij-35 ,pH7.6) 中37℃ 孵育42h。
6.孵育結束后經染色液(0.05% Coomassic 亮藍、30%甲醇、10%乙酸) 染色3h,及脫色液A、B、C(甲醇濃度分別為30%、20%、10 % ,乙酸濃度分別為10 %、10 %、5%) 分別脫色0.5、1、2h后，顯示出MMP-2（72KD） 和MMP -9（92 KD）為位于藍色背景上的透亮帶，用凝膠圖像分析系統分析讀取條帶面積，寬度和灰度值，做統計分析。

注意事項：
1.制備聚丙烯酰胺時應注意排除氣泡 。
2.明膠酶譜的活性受鈣離子，鋅離子，和PH值等因素的影響，因此緩沖液 配制應嚴格準確，盡量用超純水，孵育溫度也掌握好。

3.用大梳子

4.孵育液的PH最好在7.5-7.6，復性的TRITON時間長了會有絮狀物，所以實驗時盡量使用新鮮配置的。

5.孵育的37度不要在CO2培養箱中，因為會改變孵育液的PH值，在普通孵箱即可。

6.明膠要4度保存，配好后1周內使用

凝膠制備：

1.玻璃板對齊后放入夾中，垂直卡緊，加滿水檢漏。

2.配10%分離膠，APS和TEMED作用為促凝，最后灌膠前加。若板不漏水，則將水倒出，并用吸水紙洗凈后灌膠，灌至大約3/4處，上面加滿水壓平。

3.配濃縮膠，同樣地，APS和TEMED最后加，分離膠灌入約30min后觀察小燒杯中剩余分離膠是否已凝，同時仔細觀察可見玻板水和膠間有一條折線，說明膠已凝固。

4.將上面的水倒去，吸水紙洗凈，灌入濃縮膠，灌滿，注意一定不要有氣泡，然后將梳子插入，注意保持水平，約30min后凝固可用。

5.拔梳子在電泳緩沖液中拔，加樣孔用小針筒沖洗干凈再上樣，注意上樣時勿使樣品逸至鄰孔，樣品混勻時要輕，不要產生氣泡，否則加樣時易導致逸出而使結果不準確。