顯微操作技術在基因編輯中的應用（三）

圖9：ESI注入8細胞階段的胚胎。鈍端毛細管

圖10：EMBL轉基因過程中使用的DMi8、Eppendorf TransferMan 4r顯微操作器和PiezoXpert壓電破膜儀。以鈍端毛細管進行胚囊注射。DIC

用于小鼠轉基因的CRISPR/Cas 9技術

用于小鼠轉基因的CRISPR/Cas9技術為靶向突變提供了工具（如ESI），但無需繁雜的ES處理工作！（當然CRISPR也可以用于ES細胞突變）。

轉錄激活子樣效應因子核酸酶（TALEN）技術是一種更為成熟的技術。TALE（轉錄激活子樣效應因子）是結合DNA特定序列的蛋白質。TALE與核酸酶融合即為TALEN，這是一種具有高度特異性的DNA剪刀。TALEN使雙鏈斷裂。修復機制導致靶基因缺失或敲除。

目前，CRISPR技術相對于TALEN技術而言并不昂貴。

另外一種基因組編輯技術是鋅指核酸酶技術，它通過在用戶指定位置上造成DNA雙鏈斷裂而發生作用。

CRIPR/Cas9技術所用的工具如下所示：

向導RNA：這種RNA與用戶修飾的靶DNA同源。向導RNA與DNA上的大約20個核苷酸結合。RNA鏈的其余部分用于結合Cas9核酸內切酶。需要對20個結合的核苷酸進行設計，以找到/發現靶序列。

Cas9核酸內切酶：切割效率高，有時甚至切割兩個等位基因。

將向導RNA和Cas9蛋白（或Cas9的DNA或mRNA）注射到受精卵里，Cas 9切割DNA，修復機制開始起作用。該方法在第一代小鼠體內產生點突變的概率高。更先進的技術是注射攜帶靶基因或突變的同源DNA以及向導RNA/Cas9混合體。經由同源重組插入DNA相當有效。

小鼠轉基因用CRISPR/Cas9的優點/缺點：

優點：

+  Cas  9切割效率非常高，有時甚至切割兩個等位基因，即可獲得同源1代小鼠！

+ 無需繁瑣的ES細胞處理工作

+ CRISPR/Cas9技術不依賴于小鼠（而PNI和ESI則依賴），即它也可用于其他物種 （豬等）。

缺點：

-  迄今已公布的最長插入片段為3kB

-  目前lox P條件性敲除效率低

需要注射高濃度黏性分子（如RNA、蛋白質），會堵塞毛細管。因此需要更粗的毛細管，而且要求平角注射！

Cas9高效率地剪切DNA,DNA的修復機制造成了點突變。

*注射gDNA+Cas9+同源的DNA

圖11：CRISPR/Cas9技術

典型的CRISPR/Cas9系統設置

與PN注射設置相同，以下除外：

將濃度較高的黏性CRISPR成分（RNA、蛋白質）注入受精卵時需要使用較粗的毛細管。這些毛細管結構筆直，內徑較大，大多數實驗室均制作。

因此極力建議沿著真正的平角方向注射（見圖10），以避免胚胎受損。

此外，使用Piezo壓電式破膜系統，可以更輕松地穿過透明帶，尤其是質膜。

顯微操作器水平移動，將目標片段注入懸浮細胞內

圖12：受精卵注射過程的注射角度。顯微操作器水平移動，零度角注射可使胚胎受損程度較輕。注射角度大于10° 將導致受精卵出現較大的“洞”，使其存活率降低。

徠卡顯微操作器的移動角度可調，也就是說，即便角度較陡，注射角度本身也是零度角！

這是徠卡顯微操作器的一大優點：黏性的向導RNA和cas9蛋白混合物所需的較粗毛細管（減少堵塞）可以沿著零度角方向注射！

其他實驗室設備（轉基因實驗室）

-立體顯微鏡是選擇和控制胚囊、ES細胞和毛細管必不可少的工具。（如TL5000、M80、Rottermann contrast）

圖13：M80及TL5000 Ergo。PN注射后的雙細胞階段。

• DIC專用玻璃底器皿，一些實驗室使用大號蓋玻片

• 毛細管：若干公司提供即買即用產品。許多轉基因實驗室自己制作毛細管。

直線注射CRISPR/Cas9需要使用內徑足夠大的毛細管。轉基因專家自己制作“高級”毛細管以達到最高效率。

需要工具：

• 拉針器（如Sutter、Narishige）

• 磨具（用于毛細管拉拔后加工）

• 顯微拉制儀（用于彎曲毛細管）

上述顯微操作器：

• 徠卡機械式顯微操作器：轉基因領域贊譽頗高的顯微操作器類型。角度可調，即使毛細管角度較陡，也可獲得零度注射角。穩健可靠，負載能力強，持久耐用。用戶眾多。當移動徠卡顯微操作器的控制桿時，可以感覺到毛細管觸及胚胎。

• Eppendorf TransferMan4r：全自動顯微操作器，具有許多附加功能。可以平角注射。氣壓式、油壓式、油壓式帶齒輪和Femtojet手動顯微注射器經常用于其他顯微操作器。性能最優，價格最高。

• Narishige：新式Takanome顯微操作器無平角操作功能。配備MOM-202D和MON-202D后可以平角操作。油壓式顯微操作器當然首屈一指。注射器：IM 9B、IM 9C、IM-11、IM300。

防震：在很大程度上取決于注射室位于地下室還是高層建筑的十層（不管需要與否）。采用被動（鐵板、沉重石桌、網球等）和主動設置。

參考文獻

1. One-Step Generation of Mice Carrying Mutations in Multiple Genes by CRISPR/Cas-Mediated Genome Engineering

2. Haoyi Wang, Hui Yang, Chikdu S. Shivalila, Meelad M. Dawlaty, Albert W. Cheng, Feng Zhang, Rudolf Jaenisch, Cell 153, 910-918, May 9, 2013

3. -Multiplexed activation of endogenous genes by CRISPR-on, an RNA-guided transcriptional activator system

4. Albert W Cheng, Haoyi Wang, Hui Yang, Linyu Shi, Yarden Katz, Thorold W Theunissen, Sudharshan Rangarajan, Chikdu S Shivalila, Daniel B Dadon and Rudolf Jaenisch, Cell Research (2013) 23:1163–1171. doi:10.1038/cr.2013.122; published online 27 Aug 2013