實驗概要
本實驗詳細介紹了顯微注射法建立轉基因小鼠模型的操作流程。
實驗原理
轉基因小鼠制備的基本原理是將改建后的目的基因(或基因組片段)用顯微注射法注入供體小鼠的受精卵(或著床前胚胎細胞)，然后將此受精卵(或著床前胚胎細胞)再植入受體動物的輸卵管(或子宮)中，使其發育成攜帶有外源基因的轉基因動物，通過分析轉基因和實驗小鼠表型的關系，研究揭示外源基因的功能，而且可進行工程動物的大量生產。
主要試劑
1. M16溶液：
稱取 0.5534 g NaCl，0.0356 g KCl，0.0162 g KH2PO4，0.0294 g MgSO4.7H2O， 0.0252 g CaCl2.2H2O，0.32 ml乳酸鈉(60% 糖漿)，0.0036 g丙酮酸鈉, 0.1000 g D-葡萄糖，0.0010 g酚紅，0.2106 g NaHCO3。溶于100ml超純水，0.22?m濾膜過濾除菌，分裝后4℃儲存不超過3周，加入4 mg/mL BSA可立即使用。
2. M2 溶液：
稱取0.5534 g NaCl, 0.0356 g KCl, 0.0162 g KH2PO4, 0.0294 g MgSO4.7H2O,
0.0252 g CaCl2.2H2O,0.32 ml 乳酸鈉(60% 糖漿), 0.0036 g丙酮酸鈉, 0.1000 g D-葡萄糖,0.0010g酚紅 0.0337g NaHCO3, 0.5000g HEPES。定容于100ml超純水，0.22um 濾膜過濾除菌，分裝后4℃儲存不超過3周。M2用于孵箱外卵的操作，用HEPES調節pH,加入4 mg/m BSA可立即使用。
3. 工作液：無丙酮酸鈉的高糖（4500 mg/mL）DMEM。具體配制見說明書。
4. 注射緩沖液：10 mmol/L Tris-HCl/0.1 mmol/L EDTA, 調節pH 為7.5。
主要設備
1．輸精管切除術用器材：彎式有齒鑷、直式有齒鑷、顯微鑷、手術剪、自動小夾涂藥器、自動小夾、帶彎針4/0絲線及持針器、直徑為10cm塑料 Petri氏培養皿（內盛70%乙醇）。
2．受精卵的采集用器材：70%乙醇、手術剪、10mL解剖剪、手術鑷、M2溶液（Sigma）、小玻璃皿等。
3．離體輸卵管中受精卵收集用器材：二氧化碳孵育箱、眼科鑷子、5號鑷子、無菌30-mm組織培養皿、解剖顯微鏡、透明質酸酶、移液管、工作液、M16溶液（Sigma）、3ml注射器等。
4．DNA顯微注射用器材
1） 受精卵的收集與移動用器材：巴氏移液管、酒精燈、特制吸管、玻璃刀等。
2） 凹玻片準備：一塊標準的凹型載玻片（硅化）、礦物油（Sigma）、工作液等。
3） 注射設備的設置：微型水力驅動設備、Hamilton Gas-Tite?注射器（250 ?l）、Intramedic?管道系統（外徑1.27mm，內徑0.86mm）、兩只玻璃管道連接頭、三通管連接器、一只帶接頭的60ml塑料注射器、一只器械套管、礦物油等。
4）受精卵的顯微注射用器材：凹玻片（顯微注射用）、倒置立體相差顯微鏡或倒置Nomarski立體光學顯微鏡、顯微操縱器、千分尺（連接添滿礦物油，且耐氣構造的250ul漢密爾頓注射器）、氣壓裝置(50ml充滿氣體的注射器) 、持卵管、預載DNA的注射針等。
5．輸卵管轉移的準備
1） 手術試劑器材：麻醉劑（阿佛丁或可他命/甲苯噻嗪）、70%乙醇、一副鈍性齒鑷、兩副5號精細鑷子、一副10cm手術剪、帶自動小夾的金屬大剪、一個小彈簧夾、外科縫線、解剖顯微鏡、纖維光學照明器、載針頭的1ml注射器、kimwipe綿紙或外科紗布、9cm 塑料皿、工作液、移液管和手動移卵管等。所有的手術器械在使用前應該徹底清洗，70%乙醇消毒或高熱滅菌處理。
實驗材料
受體母鼠的準備：
輸卵管轉移的受體鼠應該為4-6周齡大小，體重在20-25克左右，嚴禁用低體重以及超重母鼠，若體重較低，其體能不足以維持妊娠，可能導致受精卵的重新吸收；若體重較重，麻醉劑被吸收入脂肪組織，降低麻醉效果，可能使手術困難，而且脂肪組織的存在意味著靜脈的存在，所以手術時切掉脂肪組織可能導致不必要的出血，難以確認手術時的操作對象。出血也可能堵塞移卵管。選擇輸卵管轉移前一天晚上與切除輸精管小鼠交配的假孕母鼠，注射當天早上母鼠可見精栓。盡管像Swiss Webster系的哺育母鼠很容易超重，隨著體重的增加，它們將表現出不同程度的感覺消失，但它們是優良的哺育母鼠。另外，它們的價格也便宜。另一個成功的鼠系是B6D2F1，它們生命力強并有一定雜合優勢。
麻醉劑：阿佛丁被證明是輸卵管轉移手術的有效麻醉劑。
實驗步驟
1．鼠系克隆
1） 動情期的探測：在轉基因動物模型的建立中母鼠動情期的監測有很高的技巧性。小鼠的動情期主要劃分為四個時期：
a. 動情后期：陰道口無擴張，周圍組織為灰白色，陰道口周圍無膨大
b. 間情期：陰道開口小，周圍組織為灰色或藍色。
c. 動情前期：陰道口逐漸擴張，陰道周圍組織由粉紅色變為紅色。
d. 動情期：陰道周圍組織顏色由紅色轉為粉紅色，陰道口背側唇可見條紋，陰道口腹側唇可見腫大，陰道有分泌液外滲。
隨機選擇動物，任何時間都可能有20%-25%的動物處于動情期。大多鼠科動物的動情期平均持續4-5天，所以對群居性動物的個體進行動情周期的同步化處理后可能在任一時期產生大量發情動物。動情期動物的選擇需兩個指標：陰道周圍組織色澤和組織膨脹的程度。動情期動物陰道組織深粉紅色，但并不同于炎癥時的色澤。另外，陰道口周圍背腹部組織腫脹而有光澤，起初其腹部可見條紋。個別陰道口組織色澤較深，但無膨脹，或陰道口稍微擴大且略帶灰色者為非動情期動物，切勿誤選它們用于交配。
2）交配的確認：陰栓形成。動物合籠后，確定雄性個體是否與母鼠成功交配非常有必要。由于雄性精液可在陰道內凝固成柔軟栓性物，成功交配后不久有陰道栓形成。以手的中指、小指和拇指捏住雌性尾根處，使小鼠頭部向下，仔細觀察陰道口部位，交配過的雌性小鼠可見有白色橡皮擦狀的陰道栓，易肉眼所見，難以確定時可用小探針檢查陰道深部是否有栓子存在。檢查陰栓應在每天早上的早些時間，因為隨著時間的推移，陰栓將被排出體外。
2．輸精管切除術
輸精管切除小鼠用于與晶胚轉移母鼠交配使母鼠假孕。小鼠6-8周齡進行輸精管切除術，CD-1 B6D2F1(C57BL6 *DBA/2)或Swiss Webster系是通常的實驗對象。阿佛丁腹腔注射麻醉劑量為240mg/kg。
1） 稱重后麻醉小鼠，背位固定小鼠，大剪刀貼近皮膚剪毛，70%的乙醇涂 搽消毒手術切口部位，以防止毛發污染切口。
2） 于生殖器前方大約1.3cm處橫行剪開下腹部皮膚，作約1cm的切口，用浸70%乙醇的紗布搽拭切口部位以清理毛發。
3） 切開腹膜，進行膀胱定位。每側都可見有一條管道走行，用鑷子輕輕夾持左側管道，提起部分使手術視野清晰可見，確定其為輸精管。
4） 將鑷子插進輸精管下方，使它們處于自然狀態，其末端垂直。同時在該位置兩端用縫線結扎輸精管，距離大約4-5毫米。在兩結扎點間剪斷輸精管，置其于紗布上確定此側手術完畢。
5） 將輸精管兩個斷端輕輕放回腹腔，如上處理右側輸精管。兩側手術完畢后，2-3根單獨縫線縫合腹壁切口。待用縫線須浸泡在70%乙醇中，保持縫線濕潤，防止結扎時粘附組織。用兩個或三個自動小夾夾閉皮膚。
6） 為保暖包裹小鼠于紗布中或將其放置于熱墊內使其蘇醒，處于麻醉狀態下的小鼠應該嚴格監護直到其完全蘇醒。手術后小鼠飼養2周后確定手術是否成功。
7） 實驗性飼養：將1-2只母鼠與輸精管切除小鼠合籠飼養，次晨進行陰道栓檢查。有陰道栓的母鼠，用磷酸緩沖液處理后24小時，其輸卵管潮紅。卵細胞應該處于單細胞期或未受孕狀態，若處于雙細胞期，則輸精管切除未完全，雄性小鼠應進行再篩選。
3．受精卵的收集
1）受精卵的采集：受精卵獲得的方法分自然排卵和激素誘發排卵以及體外受精三種方法。
誘發排卵法：雌性小鼠生后6—8周達到性成熟，性周期均為4—5 日，其排卵時間可用飼養室的明亮和黑暗進行調節，所以必須對飼養室的明暗規律進行準確嚴格地管理。
性周期是卵泡刺激素和黃體生成素相互作用的結果，我們可以從外部給予這些激素誘發排卵。向成熟雌小鼠腹腔內注射5國際單位(IU)的孕馬血清促性腺激素(PMSG)之后，約在48—54h后再將2.5-5.0 IU的人絨毛膜促性腺激素(hCG)注射于同一小鼠腹腔內，約12h后即可誘發排卵。排卵數量可達自然排卵的2倍，效果很好。雌小鼠給予hCG后應立刻與雄性合籠。成熟雄小鼠應按每籠飼養1只，雄性小鼠大小在12周齡到1年。合籠時，須將激素化雌性小鼠放進雄小鼠的籠中。雄小鼠釋放促雌性發情的外激素，在交配過程中建議不換籠，交配過的雄小鼠，間隔一周后才進行下次交配。
顯微注射的受精卵最好于交配后次晨注射前幾小時收集，此時易進行注射操作。交配后過夜小鼠的陰道栓易見，可用交配指示劑指示。對超排卵的交配母鼠體內進行陰道栓計數一般正常。低比率的有栓母鼠說明促性腺激素失去效力或雄性小鼠交配過度或雄性小鼠老齡化。收獲受精卵必須打開小鼠腹腔，輸卵管必須仔細切開。輸卵管沖洗術或輸卵管壺部切開術都可作為收集受精卵的方法。
2）腹腔內輸卵管的切開
a. 通過斷頸或二氧化碳吸入快速處死小鼠。
b. 將動物背位固定在無菌干燥的吸水紙上，剪毛并用70%的乙醇徹底涂搽手術部位。以避免毛發污染手術視野。
c. 持眼科鑷捏緊下腹部正中線皮膚，用外科剪作小的橫切口，剪刀鈍性分離充分暴露手術視野，或鈍性撕開皮膚暴露腹膜。用眼科剪打開腹膜，充分暴露腹腔與子宮角部手術視野。子宮為Y形，為起自盆腔膀胱后的肌性器官，向上分支為兩側子宮角，向上橫行深入腹腔。
d. 用鑷子距輸卵管卵巢6-7mm處夾持子宮角翻轉后輕輕拖出腹腔，在鑷子捏點下部子宮角下方附近刺破腸系膜，清除腸系膜組織遠離子宮角與輸卵管，并防止用力過大壓破子宮角與輸卵管連接處。
e. 用鑷子拖出脂肪墊，卵巢，輸卵管以及子宮部件。小心剪掉卵巢與輸卵管之間的薄層膜，然后剪下輸卵管和部分子宮角，將其盛放在盛工作液的小玻璃皿中，對另一側輸卵管重復上面操作，完畢后如上處理下一只動物。
3）離體輸卵管內受精卵的收集：解剖鏡下觀察近輸卵管漏斗部上部明顯潮紅此為壺腹部。用眼科鑷子撕開膨大的壺腹部即看到包繞受精卵的丘細胞團。
a. 轉移輸卵管于含工作液的小玻璃皿中。
b. 眼科鑷子夾持壺腹部，并用另一只眼科鑷子撕開膨大的輸卵管，游離的受精卵慢慢流出，也可以用鑷子輕輕擠壓輸卵管將受精卵推出裂口。
4）透明質酸酶處理與受精卵的漂洗
工作液中受精卵可能成團狀，微注射用的受精卵必須是單個細胞，而且無細胞碎片。漂洗細胞時，首先用工作液除去細胞碎片。不成團細胞可用無菌移液管收集到盛工作液的玻璃小皿中，注意把握移液管的張力。溶解在工作液中的透明質酸酶對細胞團以及復合體進行消化時必須嚴密觀察，一旦細胞團溶解立即將單細胞轉移到新鮮工作液中，防止消化過度。
用工作液漂洗2-3次，清除碎片后，用無菌移液管將受精卵置于特殊培養基（M16），放于37℃, 5% CO2孵箱中待注射，此培養基上層覆蓋高壓消毒礦物油，可防止污染同時防止培養基水分蒸發影響pH。受精卵在體外發育較體內快，在孵育過程中注意觀察一些受精卵清晰可見原核形成，在此期間可先選出原核清晰的卵(形態稍不規則)用于注射，其它卵繼續培養。注射后，再篩選，再注射，直至得到滿意的注射卵數。
4．顯微注射
1）導入DNA的制備：顯微注射首先涉及導入DNA的制備，顯微注射的轉入基因通常為去除載體序列的線狀DNA，轉基因所用載體是真核表達載體，即含有在哺乳動物細胞內表達的真核啟動子。所謂組織特異性的實現多是通過組織特異性啟動子來實現組織特異性表達的。制備轉基因小鼠，必須對待導入DNA進行分離純化。實驗必須用經過瓊脂糖電泳鑒定并確定其純度的DNA，對導入基因的大小沒有特別的限制，長鏈DNA也可成功。 實驗中注意防止一些雜質堵塞注射針，如瓊脂糖顆粒、纖維物質等，需盡量超速離心除去。
DNA的注射質量是實驗成功的關鍵。研究表明DNA注射的起始濃度大約在1ng/ml，當DNA注射濃度超過一定上限時，實驗效果不佳，而且大于5 ng/ml會產生明顯的毒性作用。
導入DNA的制備程序如下：
a. 通過在Tris/acetate/EDTA緩沖液中進行瓊脂糖凝膠電泳從載體中分離待插入DNA，用5mg/ml溴乙啶染色。
b. 為防止對插入DNA的溴乙啶的破壞，用長波紫外光顯影。
c. 切下目的基因所在凝膠片，電泳制備目的DNA，或用Qiaex凝膠抽提試劑盒進行抽提。
d. 乙醇沉淀目的DNA。在樣品中加入1/10體積的3M乙酸鈉，混勻，再加入2-2.5倍體積無菌100%乙醇進行沉淀。
e. -20℃ 孵育過夜后，超速離心機10000轉/分，離心5分，收集沉淀，重懸沉淀于Elutip緩沖液。
f. 用Elutip-D微型柱對目的DNA過柱處理。
g. 按照步驟4重新沉淀DNA，用70%乙醇漂洗沉淀2-3次，真空干燥沉淀。清洗與干燥過程極其重要，因為殘余的鹽和乙醇對受精卵的發育是致命的。
h. 注射緩沖液（10 mmol/L Tris-HCl/0.1 mmol/L EDTA, pH 7.5）重懸沉淀，緩沖液必須是Milli-Q純化水配制
i. 通過熒光光度計或凝膠電泳比色法評估目的DNA的濃度
j. 用注射緩沖液調整目的DNA的濃度在5-10ng/?l.
2） 器械準備
a. 注射針的制作
注射針是內含玻璃細絲的薄壁毛細吸管，它可以通過毛細管虹吸作用進行載樣。用拉針儀（SUTTER,P2000 laser based micropipette puller,具體操作程序詳見產品說明書）可以把注射針水平或垂直扯下來。必須保證制備的毛細管可以進入拉針儀這樣加熱組件大約在毛細管的中央位置。一般用內徑為1.0mm的微電極管為材料制作注射針,微電極管可以買到,它與拉針儀是匹配的。另外，應該對拉針儀的設置進行選擇，使細絲溫度和扯拉力度(主拉力和次拉力)將處于最佳狀態。具體需要預實驗來確定其最佳設置。待用注射針應該用蒸餾水嚴格清洗以除去殘留炭化物顆粒。嚴格的實驗微電極管在使用前應經過泡酸、泡蒸餾水和硅化的程序,但有人省略了此步也有較好的結果,經拉針儀拉針后就沒法清洗,好的拉針儀是不會殘留炭化物顆粒,若拉成后清洗其針尖很容易斷掉,可用Narishige Japan model PN-30。
b. 持卵管制作
為避免機械損傷，持卵管口應該是鈍性末端而且其孔隙有限，使受精卵輕輕依附在負壓管道中。這種高度密實可抵抗密封系統的破損，而密封可以減少受精卵注射時的旋轉運動。持卵管的口部應該光滑，平整及與其長軸垂直。具體制備操作：雙手執毛細玻璃管的兩端，將管的中部置酒精燈外焰燒紅至變軟后離開火焰，同時雙手外伸，將燒軟的部分拉細。用玻璃刀或細沙輪小心將細管切開，在鏡下觀察切口應平齊(如不平齊，應重新切割)。然后于酒精燈火焰底部的藍焰邊緣處將切口鈍化處理(即將管口于藍焰邊緣處做短暫灼燒，然后于顯微鏡下檢查管口形狀，如此反復，直至滿意)。如實驗室配有持卵管制作儀，則可在顯微鏡下直接監視熱燈絲對持卵管管口灼燒后的形狀，及時調整二者之間的相對位置，更易得到滿意的持卵管。持卵管應該做調整，用熔斷儀將其打彎使其末端成15度(不同的顯微注射儀度數可能有差異,打彎成25度左右,一般為20-25度)輕微彎曲以方便使用。此持卵管為不含細絲的玻璃，顯微鏡下用含刻度目鏡確定持卵管的外徑應該為100-140um。持卵管的內徑很重要,可用鉑金燈絲灼燒管口,使其內徑為30-50um左右,內徑要能吸住受精卵,而又不把卵吸入管內。為便于操作，持卵管可進一步調整使其末端輕微彎曲（15度）。
c. 洗卵管制作
點燃酒精燈，調節火焰到最佳。捏持玻璃毛細吸管或巴氏移液管在火焰上焰旋轉過火。
當吸管開始變軟，快速撤離火焰，向外急劇扯拉使吸管變長，形成口徑大約200ul的吸管。注意制備過程中離開火焰的時間以及扯拉的力度，盡量保證制備吸管的一致性。
為吸管評分，輕柔地折斷吸管，辨別其聲音是否清脆，或扯拉吸管或只做彎曲直到兩根同分數的吸管斷裂為止。
解剖鏡下(要在熔斷儀上)檢查吸管，并對其進行調整，確定其口徑以及管口光滑平整。
d. 移卵管的制作
用于轉移注射后受精卵到假孕鼠體內的吸管制作過程同上洗卵管。不同的是，這些吸管的口徑稍微小一些，大約150um(150-160um)，直徑比單受精卵的口徑略大一些，將促使卵細胞精細的充滿移卵管并轉移到輸卵管。移卵管在打磨過程中要求管口更光滑平整以減輕插入輸卵管時對輸卵管的損傷，同時必須注意移卵管頭在火焰上時間不可太長，防止融化堵塞。管口要平且要鈍化。
e. 凹玻片的準備
必須準備適合承載用于微注射的受精卵的凹玻片做微注射槽，也可用培養皿做注射槽，載玻片上的受精卵應該浸潤在pH緩沖工作液中，如M2溶液，使受精卵在孵箱外保持30-40分能受到保護。具體凹玻片的準備程序如下：
在超凈臺內利用手動移液器將M2溶液加入凹玻片窩的基底部形成直徑大約0.6cm液面，液滴的液面要水平平整，避免液體的折射效應。吸取胚胎實驗用礦物油于M2溶液上，礦物油的量以剛剛達M2溶液最高液面為宜，將凹玻片置于倒置顯微鏡的載物臺上，在低倍鏡下調節焦距，使M2溶液液滴的底面清楚為止。
覆蓋礦物油的作用：防止液滴脫水以及濃縮；使受精卵處于無菌狀態；固定M2溶液液滴。
從孵箱中取出受精卵，用移卵管吸出受精卵并用M2溶液洗滌2-3次，調整實驗用量，將其置于凹玻片的M2溶液中，調焦使在低倍鏡下清楚地看到受精卵的輪廓，并且保證受精卵有足夠空間自由移動，用持卵器將卵匯聚到一起，移卵時注意不要將氣泡移入，影響操作視野。
f. 顯微注射設備
顯微注射儀的基本工作原理是運用立體倒置相差顯微鏡進行觀察監測，顯微鏡兩側各置一臺顯微操作儀，一側接持卵管，另一側接注射針，可調節持卵管或注射針的空間位置。持卵管通過塑料管連接一個裝滿礦物油的帶微調的注射器，通過調節壓力控制卵的運動。注射針通過塑料管連接有壓力泵的注射儀。將注射時間與壓力固定后，進行注射操作。操作系統有LEICA AS TP基因轉殖操作系統（major instruments.co.Ltd）等，具體操作程序按其說明書嚴格進行。
3）注射針內DNA的裝載
把注射針的鈍性頭浸在盛待注射DNA的管中，溶液通過毛細吸管的虹吸作用進入注射針。注射針的末端應該一直留在DNA溶液中直到注射針末端有小泡形成。這說明DNA溶液裝載完畢。仔細檢查注射針針頭末端，距其幾毫米處可見一個小凹液面。最后可將載滿DNA溶液的吸管裝在持針器或固定在器械環中待用。
4）受精卵的顯微注射
受精卵的顯微注射過程相對簡單，制作大量樣品過程中，為保證顯微注射量的一致性，必須通過大量反復有效的練習才可以成功。
a. 置凹玻片于顯微鏡下，低倍聚焦。
b. 調節持卵管，注射針與受精卵在同一視野下后，轉換到高倍鏡（32X）下時位置稍微低于受精卵，以便自如地操作受精卵。
c. 挨近注射針到工作液或油界邊緣，稍微進入油界。在注射前，增加注射針的壓力可見DNA溶液泡在油內形成囊狀，以此確定DNA溶液流存在。
d. 如果未見DNA溶液流，則輕輕摩擦持樣器鈍緣，漸漸的打開注射器針頭。針頭重新進入油內確定DNA溶液流的存在。
e. 移動持卵管回到受精卵下部。通過微分驅動水壓控制系統使持卵管內產生溫和的負壓，并使持卵管末端吸住受精卵。此操作必須確保受精卵基底部與凹玻片基底部輕輕接觸。注意不宜吸得過緊，否則會使卵變形，甚至會將卵吸人持卵器內。
f. 對持卵管內真空進行緩慢調節，使持卵管內受精卵輕柔地旋轉，使卵內原核位于持卵管口的遠側端。
g. 維持持卵管穩定，使注射針的針頭緊靠受精卵的透明帶，進行調節并使針與原核處于同一平面上。用注射針依次刺破透明帶，細胞外膜，前核核膜，進入核膜內，受精卵的透明帶易被針尖刺破，前核核膜相當有彈性，應用不同的方法進行嘗試突破此結構。操作時避免與核接觸損傷核仁。
h. 保持注射針位置固定，輕輕增加壓力使DNA溶液流入前核中。注射過程中可能出現的現象如下：
① 注射后原核將膨大到原來的兩倍左右，表明注射成功，然后直接抽出注射針。
② 一氣泡出現在注射針尖端，透明帶可能膨脹，表明受精卵的膜非常艱固，沒有被刺破，此時需繼續向內進針，直到尖端進入核，同時要小心注射針尖端極易破損。
③ 注射針壓力較大，看不到任何現象，可能是注射針堵塞，需換針或更換DNA溶液。
④ 若見胞質顆粒涌出到卵黃周圍空間，說明受精卵破裂。注射過程中，發現卵破裂數目較多，則需更換注射針。一支注射針一般可注射5—10枚卵。
i. 用持卵器移動受精卵到凹玻片凹內相對隔離的位置，以區分注射組與非注射組。重新安裝持卵管并進行下一組操作。
5．受精卵的輸卵管轉移
1）受精卵的輸卵管注射
a. 將麻醉小鼠放置于一塑料平皿蓋上，固定小鼠牙齒于皿緣以確保小鼠氣道通暢。用70%乙醇涂搽切口部位。也可預先在手術部位剔除毛發。
b. 將受精卵從培養液轉移至工作液內。因受精卵在轉移過程中在孵箱外操作，所以應該將其從培養基中移到工作液中。
c. 用移卵管裝載受精卵。移卵管的正確裝載對輸卵管轉移的成功非常重要。如圖11-1所示，吸取一定量的工作液在移卵管尖端，然后吸取些許空氣制成一個小氣泡。再吸取與氣泡體積大約相當的工作液，緊接著在吸取另外一個小氣泡。收集受精卵于盡可能小容積的工作液中，將其線形排列于移卵管中。當所有的卵被負載后，再吸取小量氣體制成小氣泡，接著吸取最終容量的工作液。氣泡將有利于對壓力進行調節，更容易使卵移動。
d. 手術暴露輸卵管復合體。如圖所示，在離中線約0.5厘米、背駝峰與后腿髖關節之間作橫行切口。仔細用浸70%乙醇涂搽切口部位，并搽去毛發。捏住一側切口皮膚，鈍性分離皮下組織。移動皮膚直到腹壁神經走行清晰可見。這時可看到腹壁下紅色卵巢或淺色卵巢脂肪墊。用眼科鑷捏住腹壁，并作約0.5厘米橫行切口，鈍性分離組織，輕輕移出脂肪墊、卵巢、輸卵管以及子宮。用彈簧夾夾住脂肪墊并保持子宮在適當位置。若子宮及子宮角頻繁滑回腹腔，在保證氣道通暢的前提下，可適當重新布置其位置。
e. 輕輕移動塑料平皿，使小鼠位于解剖顯微鏡下，適當調節顯微鏡及小鼠位置使其輸卵管卷曲部清晰可見。
f. 用眼科鑷于漏斗部透明囊膜處鈍性撕開小口，并防止撕裂血管，引起出血。必要是撕裂口部位局部應用腎上腺素以減少出血，并用紗布擦拭保持操作視野干凈。
g. 一旦漏斗部清晰可見，用鑷子夾持其邊緣并充分暴露漏斗管口。在避免壺腹損傷的前提下，盡可能插入移卵管。
h. 在壓力可調節的前提下，輕輕把卵吸吹進入漏斗部。氣泡可以阻止卵回流而且很容易使卵進入輸卵管漏斗管。若吹卵的壓力太大，那么移卵管口可能抵在輸卵管壁上，這時可稍微后撤移卵管再進行操作，也可能由于血塊堵塞移卵管，若這樣，則應該吹出細胞在培養皿中，重新吸卵。
i. 移卵操作完成后，撤回移卵管，去除器械，按原本位置將各器官重置于腹腔內。
j. 縫合切口，用小夾夾持皮膚。常用自動小夾代替縫線，這樣可以避免小鼠啃嘶縫線，切口裂開。
k. 若進行雙側手術，則于另一側子宮角重復上述操作。
l. 手術完成后，安置小鼠于清潔的籠中。麻醉狀態下，小型哺乳動物無法有效維持機體溫度。所以應該注意小鼠的保溫。可以用熱墊保持其溫度直到動物蘇醒。所有的動物在回籠前20-30分可蘇醒。由于妊娠很容易使受體母鼠產生應激反應導致流產或食子，所以對受體母鼠必須嚴格監護。
2）注射后期監護：手術后嚴格監護防止并發癥的發生非常重要。麻醉易誘導小鼠出現血壓升高，所以手術后必須嚴密監護至少2小時，同時推薦進行保溫處理。
處于麻醉狀態的小鼠應該用軟紗布包裹，而且籠中加墊草墊以及軟材料，并保持鼠籠溫度。正常體溫的維持可以縮短動物處于麻醉狀態的時間。
手術后小鼠常規4-5天觀察一次以確保小鼠處于恢復中，清醒小鼠應活動自如。腹腔手術后小鼠有發生腸疝的可能。所以手術時保持切口盡量小，縫合嚴密，而組織膠水的正確應用可以避免此類并發癥的發生。皮膚必須用縫線或不銹剛夾夾閉，手術后1-2周可拔除。如果動物狀態不良，表現厭食，脫水，或明顯弓背，通過動物飲水可給予羥苯基乙酰胺以及同類止疼藥。若發生脫水，可腹腔注射0.9%生理鹽水或林格氏液。若仍無改善可在麻醉狀態下重新打開手切口確認是否有疝發生。若動物狀態無明顯好轉，最終采用安樂死進行。
5. 轉基因小鼠的鑒定
產出的鼠仔中，屬轉基因小鼠者，約占全部仔小鼠的20％-30％。因此，對轉基因小鼠必須進行鑒定篩選。
1) 轉基因整合檢測
鑒定轉基因小鼠最簡單的方法是從小鼠尾尖提取基因組DNA，檢測其基因型。檢測方法包括PCR和Shouthern 雜交。
a. 基因組DNA的提取：
將離乳期小鼠（>4周齡）麻醉標記。
用一只手抓住小鼠，另一只手持消毒剪剪下約1cm的鼠尾。
將剪下的鼠尾放入500?l消化緩沖液中（50mmol/L Tris-HCl, pH8.0; 100mmol/LEDTA; 100mmol/LNaCl; 1%SDS）, 并加入蛋白酶K使其終濃度為100 ug/ml，55℃下震蕩孵育3~4 小時或過夜孵育。
加入5 ul RNA酶A，370C孵育1-2小時。
b. PCR檢測： 轉基因的初始篩選通常采用PCR檢測技術。該技術操作簡便、快速、費用低而有效，適合大量標本的分析。由于該技術特別敏感，可能產生假陽性結果。因此，在操作過程中必須特別小心，避免質粒DNA或其它標本的基因組DNA的污染。假陽性的產生對轉基因小鼠的篩選工作將是致命的。PCR實驗應采用雙復管，甚至三復管。陽性結果最好用Southern雜交技術進一步證實。
c. Southern blot分析：該技術雖然沒有PCR技術那樣敏感，且費力費時，但是避免了因污染導致假陽性結果的麻煩，可以得到目的基因整合后的基因組、整合位點數目、轉基因拷貝數等的確切信息。
2) 轉基因表達檢測
轉基因整合檢測是確定目的基因是否整合到了小鼠的基因組中，同時可確定整合的位點和拷貝數，這在遺傳學上是十分重要的。而轉基因表達檢測是確定目的基因在轉基因小鼠器官組織中表達的時空分布。其檢測包括RNA分析技術和蛋白質檢測技術。
a. RNA的分離：根據實驗者的需要從轉基因小鼠組織或細胞中提取總RNA或mRNA。分離總RNA比較簡單，且適合做基因做基因轉錄分析。
b. Northern 印跡分析：該技術用于定性檢測轉基因動物組織或細胞中轉基因轉錄的相對水平。
c. RT-PCR檢測：該技術可定量或半定量檢測轉基因小鼠組織或細胞中轉基因特異表達的mRNA，且非常敏感，Northern 印跡未能檢測到的轉錄子，該技術亦可檢測到，甚至可測出1000個細胞中的一個拷貝的轉錄子。
d. Western 印跡分析：該技術通常用于轉基因小鼠組織或細胞中轉基因編碼蛋白的表達水平。
e. 免疫組織化學分析：該法可檢測轉基因編碼蛋白表達在轉基因小鼠中的組織分布。有多種實驗方法，可參看相關的免疫學檢測技術書籍。