作者：張淑紅，吳清平，張菊梅
作者單位：廣東環凱微生物科技有限公司，廣州510070；2．廣東省微生物研究所廣東省菌種保藏與應用重點實驗室，廣州510070
[摘要] 目的：研究顯色培養基對單核細胞增生李斯特菌的檢測效果，探討建立新型快速檢測方法。方法：檢測按國標GB4789—33程序進行。結果：人工污染樣品和實際樣品檢測中，顯色培養基CHROMagar Listeria和HKListeria與傳統平板OXA和MMA可以達到相同的檢測限和靈敏度，且具有更高的特異性。結論：用顯色培養基檢測單核細胞增生李斯特菌是一種新途徑，可大大提高檢測效率。
[關鍵詞] 顯色培養基；單核細胞增生李斯特菌；快速檢測
單核細胞增生李斯特菌(簡稱“單增李斯特菌”)是一種重要的食源性致病菌，廣泛存在于肉類、禽類、乳制品等食品中，引起新生兒腦膜炎和成人敗血癥等疾病，是食品微生物的常檢項目之一。美國食品和藥品管理局(FDA)、美國農業部(USDA)、ISO11092標準、國際分析委員會(AOAC)和中國國標(GB4789—33)等都建立了各自的檢測方法，所用培養基包括OXA、PAL、MMA、MOX、TSA—YE等，但只適用于李斯特菌的選擇性分離培養，不能特異性分離單增李斯特菌。目前仍需一種選擇性平板可以有效的分離單增李斯特菌。鑒于此，一些顯色培養基如CHROMagar Listeria(法國科瑪嘉)、HKListefia(廣東環凱)等不斷開發出來，用于單增李斯特菌的快速檢測中，直接根據菌落顏色和形態就可對菌種作出鑒定，大大縮短了檢測時間，提高了檢測效率。本文通過對人工污染樣品和實際樣品檢測，比較了CHROMagar Listeria、HKListeria與傳統平板OXA、MMA的檢測效果。
1 材料與方法
1.1 菌株來源
單增李斯特菌Listeria monocytogenes ATCC94002、大腸桿菌Escherichia coli 8099、沙門菌Salmonella typhi、金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus、蠟樣芽孢桿菌Bacillus cereus、糞鏈球菌Enterococcus faecalis、英諾克李斯特菌L.innocua(簡稱“英諾克”)、威爾李斯特菌L.welshimeri(簡稱“威爾”)分離株由廣東省微生物研究所微生物檢測新技術發展中心提供。
1.2 培養基及試劑
HKListeria、CHROMagar Listeria、OXA、MMA、TSA-YE、LB1、LB2李斯特菌增菌液、萘啶酮酸、丫啶黃、李斯特菌生化鑒定管等由廣東環凱微生物科技有限公司提供。
1.3 主要儀器
法國生物梅里埃公司Biomerieux全自動微生物鑒定系統，API Listeria生化檢測試劑條。
1.4 樣品
試驗所用樣品豬肉、牛肉、雞肉、魚肉、熟食、蔬菜、蛋糕等，均采集于附近超市和肉菜市場。
1.5 方法
1.5.1培養基制備 HKListeria、CHROMagar Listeria、OXA按生產廠家的說明書制備，MMA、TSA-YE按國標GB4789-33法配制。
1.5.2顯色培養基特異性檢驗 將單增李斯特菌、英諾克、威爾、金黃色葡萄球菌、蠟樣芽胞桿菌、糞鏈球菌在腦心浸液瓊脂，大腸桿菌、沙門菌在營養瓊脂培養基上培養24 h后，劃線接種HKListeria、CHROMagar Listeia、OXA、MMA培養基，37℃培養24 h，觀察。
1.5.3顯色培養基靈敏度檢驗 (1)挑取1環單增李斯特菌加到10 ml 0.85％生理鹽水中配成原液，然后進行10倍梯度稀釋，取10-4、10-5、10-6 菌液各100ul ，分別涂布HKListeria、CHROMagar Listeia、OXA和TSA-YE平板。37℃培養36h，計數菌落數。(2)取單增李斯特菌10-3～10-8濃度菌液，分別加入2．1×104cfu／ml金黃色葡萄球菌、1.4×104 cfu／ml蠟樣芽孢桿菌、1.6×104 cfu／ml大腸桿菌和1.3×105cfu／ml糞鏈球菌，震蕩混勻，取100分別涂布HKListeria、CHROMagarListeia和OXA平板，以10-3～10-8 純菌液涂布TSA-YE做對照，37℃培養36 h，計數單增李斯特菌菌落數，比較在干擾菌株濃度較高而目標菌較低時各培養基的靈敏度。
1.5.4人工污染樣品
1.5.4.1 純菌污染樣品檢測：將單增李斯特菌梯度稀釋后，取10-3—10-8“菌液各1 ml，分別加入到10 g豬肉和9 ml牛奶中，均勻混合2 h。按國標GB47893—33方法增菌，劃線接種HKListeria、CHROMagar Listeia、OXA和MMA培養基，37℃培養24 h，觀察單增李斯特菌在各培養基上的檢出情況。
1.5.4.2 單增李斯特菌和非李斯特菌混合污染樣品檢測：將單增李斯特菌、金黃色葡萄球菌、蠟樣芽孢桿菌、大腸桿菌、沙門菌、糞鏈球菌近似等比例混合后，10倍梯度稀釋成10-3～10-8 不同濃度的混合菌液，各取1 m1分別加入到10 g豬肉和9 ml牛奶中，按國標GB47893—33增菌后，劃線接種HKListeria、CHROMagar Listeia、OXA和MMA培養基，37℃培養24 h，觀察單增李斯特菌在各培養基上的檢出情況。
1.5.4.3 單增李斯特菌、英諾克和非李斯特菌混合污染樣品檢測：由于樣品中李斯特菌數量一般較少，約1—10 cfu／ml，而英諾克是單增李斯特菌的主要競爭菌，其他李斯特菌對單增李斯特菌影響不大，因此將單增李斯特菌和英諾克按100 cfu：10 cfu、10 cfu：10 cfu和10 cfu：100 cfu 3種近似比例混合，然后加入(104 -105 )cfu／ml金黃色葡萄球菌、(104 -105 )cfu／ml蠟樣芽孢桿菌、(104 -105)cfu／ml大腸桿菌、(104 -105 )cfu／ml沙門菌、(104 -105 )cfu／ml糞鏈球菌，制成混合菌液，分別加入到9 ml牛奶和10 g豬肉中，按國標GB47893—33法，劃線接種HKListeria、CHROMagar Listeia、OXA和MMA平板，37℃培養24 h，觀察單增李斯特菌在各培養基上的檢出情況。
1.5.5實際樣品從市場購買實際樣品共62份，按國標GB4789—33增菌，劃線接種HKListeria、CHROMagar Listeia、OXA和MMA平板，觀察李斯特菌的檢出情況。
1.6 分離鑒定
將疑似菌落進行純化，用法國生物梅里埃公司API Listeria試劑條，并結合傳統生化鑒定方法進行鑒定。