暗視野光學顯微鏡使用實驗

生活的細菌在明視野顯微鏡下觀察是透明的，不易看清。暗視野顯微鏡的原理與來自縫隙的一束強光通過暗室時，可清楚地看到其中細微灰塵的現象是一樣的，即給樣品照明的光不直接穿過物鏡，而是由樣品上反射或折射的光進入物鏡，那么，在漆黑的視野中，由于反差增大了，使樣品能夠看得更清楚。因用暗視野法可以在黑暗的視野中看到光亮的菌體，故在觀察生活細菌及細菌運動時常采用此法。
 

暗視野顯微鏡的構造主要是采用一種特殊的聚光器，在聚光器的下方中央為圓形黑盤所遮，光僅由周緣進入，使光會聚于載玻片上，并斜照物體，物體經斜射照明后，發出反射光可進入物鏡，這樣，造成顯微鏡視野黑暗，而其中的物體明亮。如無暗視野顯微鏡時，只需將明視野顯微鏡上的聚光器取下，換上暗視野聚光器即可；也可在明視野顯微鏡聚光器下面的濾光鏡支架上放一片星形擋板（star diaphragm）構成暗視野，這種方法適用于低倍鏡觀察。
 

在暗視野中，由于有些活細胞其外表比死細胞明亮，所以暗視野也被用來區分死、活細胞，此技術現已被用于各種酵母細胞的死、活鑒別。此外，暗視野顯微鏡對于觀察嬌弱的微生物，如梅毒密螺旋體（Treponema pallidum）特別有用。

釀酒酵母

香柏油

暗視野光學顯微鏡載玻片

1.  選厚薄在1.0~1.2 mm 的干凈載玻片一塊，滴上釀酒酵母懸液，加蓋玻片（注意切勿有氣泡存在）。

2.  將聚光鏡光圈調至1.4。

3.  光源的光圈孔調至最大。

4.  在聚光器上放一大滴香柏油，將標本置載物臺上，旋上聚光器使油與載玻片接觸（不能有氣泡發生）。

5.  用低倍物鏡及7×目鏡進行配光對準物體。調節聚光器的高度，首先在載玻片上出現一個中間有一黑點的光圈，最后為一光亮的光點，光點愈小愈好，由此點將聚光器上下移動時均使光點增大。

6.  換上所需目鏡和高倍鏡，緩慢上升物鏡進行調焦，至視野中心出現發光的樣品。

7.  在蓋玻片上滴一滴香柏油，并將油鏡轉至應在位置調節配光，進行觀察。

1.  進行暗視野觀察時，聚光鏡與載玻片之間滴加的香柏油要充滿，否則照明光線于聚光鏡上面進行全面反射，達不到被檢物體，從而不能得到暗視野照明。

2.  在進行暗視野觀察標本前，一定要進行聚光鏡的中心調節和調焦，使焦點與被檢物體一致。

3.  由于暗視野聚光鏡的數值孔徑都較大（NA=1.2~1.4），焦點較淺，因此，過厚被檢物體無法調在聚光鏡焦點處，一般載玻片厚度為1.0 mm 左右，蓋玻片厚度宜在0.16 mm 以下，同時載玻片、蓋玻片應很清潔，無油脂及劃痕，否則都會嚴重地擾亂最
終的像。