曹博團隊聯合MIT開創RNA絕對定量測序新技術

　　RNA高通量測序技術（RNA-seq）是研究基因表達與調控領域的重要技術手段。然而目前RNA測序技術只能實現相對定量，以及無法檢測含表觀遺傳修飾或復雜高級結構的RNA分子，阻礙了RNA組學研究的進一步發展。

　　2021年4月15日，Nature Biotechnology 在線發表了曲阜師范大學曹博課題組與美國麻省理工學院Peter Dedon課題組合作，題為“Quantitativemapping of the cellular small RNA landscape with AQRNA-seq” 的研究論文。該研究開發的AQRNA-seq （Absolute Quantification RNA-seq），首次實現了細胞內RNA分子的高通量測序、絕對定量分析、表觀修飾定位、代謝片段鑒定等全面組學分析，尤其是含有高度表觀修飾的tRNA分子等；利用AQRNA-seq，從絕對定量的角度，成功描繪了結核分枝桿菌和人類癌細胞內tRNA/miRNA組的完整表達和代謝圖譜。AQRNA-seq技術通過PCT Route，獲得美國、歐洲及中國的ZL授權，有望推動RNA測序進入絕對定量新時期。

　　RNA組學研究，即通過對細胞內全部RNA分子進行系統研究，以從整體水平闡明RNA的生物學功能，是多年來后基因組時代生命醫學領域的研究熱點和重點。目前，RNA-seq作為RNA高通量定量分析的重要技術基礎和通用手段，存在兩點不足之處：（1）由于傳統建庫過程中，RNA分子的捕捉等步驟具有序列偏好性，只能用于分析不同樣品間相同RNA分子的相對變化倍數，而無法實現同一樣品中不同RNA分子的絕對定量；（2）RNA分子上的表觀遺傳修飾或復雜高級結構，可以阻斷或影響逆轉錄反應，導致RNA-seq無法檢測或定量分析含有修飾的RNA分子。

　　目前越來越多的RNA分子被發現含有化學修飾，而RNA絕對定量技術的缺失，限制了人們對細胞內RNA群體多樣性和復雜性的進一步理解；因此，開發一種RNA高通量絕對定量技術，并克服RNA修飾的干擾，是RNA組學研究領域亟待解決的關鍵技術難題。

　　曹博課題組開發的AQRNA-seq技術提供了一套不同于傳統方法的全新RNA建庫策略，并精確定量分析所有關鍵環節（圖1），最終實現了：1）對細胞內全局性RNA分子無偏差、高靈敏度捕捉；2）樣品中所有小RNA的測序讀數和拷貝數之間呈直接線性相關，從而對RNA分子絕對定量分析；3）克服RNA修飾對定量的干擾；4）精確定位RNA分子上的修飾位點。

圖1 AQRNA-seq技術流程及RNA測序讀數和拷貝數之間的直接線性關系

　　該研究進一步利用AQRNA-seq，針對tRNA因含有高度修飾而無法利用傳統方法進行高通量定量分析的難題，完成了國際上第一個完整的tRNA及其衍生片段（tRNA-derivedfragments, tRFs）絕對定量分析的代謝圖譜：以結核分枝桿菌為研究對象，揭示了其在生長期和潛伏期轉變過程中，tRNA表達譜及其表觀修飾的動態變化規律；同時，還首次發現了該細菌在應激過程中產生的大量未知新型tRFs（圖2）。這一發現暗示tRNA和tRFs在結核分枝桿菌細胞周期中的重要調控功能，對特征性分子進行深入研究，將為肺結核的診療提供潛在RNA分子靶標。

圖2 結核分枝桿菌進入潛伏期過程中tRNA表達譜及其表觀修飾變化規律

　　該研究還從絕對定量的角度，解析了人類乳腺細胞在癌變發生不同階段miRNA的變化規律（圖3），發現了多個特征性miRNA分子，這些特征性miRNA分子為癌癥診療研究提供了新型分子靶標；同時，AQRNA-seq揭示了已有研究中關于miRNA鑒定的誤區：目前已知的多數miRNA異構體（isomers，'isomiRs'），即miRNA末端序列多樣性并非天然存在，而是傳統測序過程中的人為引入。這一發現刷新了人們對miRNA群體的認知，為鑒定miRNA的多樣性和復雜性提供了重要參考。

圖3 人類乳腺細胞癌變過程中特征性miRNA以及人為引入的末端多樣性

　　另外，近期曹博教授課題組已經成功開發AQRNA-seq 2.0，通過進一步設計并優化多個關鍵步驟，在絕對定量的基礎上，實現了PCR dimer-free的建庫技術。該版本可以與現有small RNA-seq技術通用，同時解決了必須通過膠回收等手段，除去PCR引物二聚體的繁瑣步驟，突破了限制RNA建庫全自動化的關鍵限制因素，有望發展成為RNA測序的新型通用平臺。