最全的液相色譜柱知識和選擇技巧

眾所周知，現代高效液相色譜分析中，色譜柱的選擇直接影響了分離效果的好壞，選擇合適的色譜柱可以縮短方法開發所需的時間，并且使方法更具穩定性。但是現在市場上色譜柱種類繁多，不同類型的色譜柱分離對象不同，因此，要做合適的選擇，必須對此有一定的認識和了解。

色譜柱參數

物理性質

柱長，內徑，如250*4.6mm。一般柱長在2—250mm，柱越長，分離度越高，但柱壓更高，分離所需時間更長;但分離度與理論塔板數的平方根成正比，所以一昧增加柱長并不是最有效的分離手段，一般情況下，150mm、5um的填料可以提供足夠的塔板數。

粒徑，影響色譜分離度。粒徑越小，分離越快，柱效越高，但柱壓力越高，柱容易被污染，導致柱壽命降低。常見分析柱通常使用5um填料，復雜的多組分樣品分離一般使用3.5um粒徑，更大內徑的制備色譜柱通常使用更大的粒徑。如果固定相選擇是正確，但是分離度不夠，那么選用更小的粒度的填料是很有用的。3.5um填料填充柱的柱效比相同條件下的5um填料的柱效提高近30%;然而，3.5um的色譜柱的背壓卻是5um的2倍，因此如何選擇填料粒徑需要根據現實情況而定。

孔徑，60A，120A，300A等。孔徑小，則含孔率高，比表面積大，載碳量高;色譜柱填料孔徑大小需和分子大小相匹配，保證分子自由進出填料孔并與孔內表面的鍵合相進行分離分配，通常要求孔徑直徑是分子直徑的3倍以上，一般小分子使用80—120A，大分子使用300A。

顆粒形狀，一般有球形和不規則形，當使用黏度較大的流動相時，球形顆粒可以降低柱壓，延長色譜柱壽命。

比表面積，指的是每克填料的表面積，如180m2/g—350m2/g，與粒度和含孔率有關;比表面積大，會增加樣品與鍵合相之間的反應，增加保留和分離度;比表面積小則可以縮短分析時間和平衡時間，并不是比表面積大或者小就更好，需要選擇合適的比表面積。

化學性質

硅膠基質：最通用的基質，強度大，化學修飾容易，但使用的pH值范圍有限(一般為2—8，特殊修飾的可以達到1—12)。

聚合物基質：多為聚苯乙烯—二乙烯基苯或聚甲基丙烯酸脂，化學穩定，應用pH范圍寬，具有更強的疏水性，對蛋白質等樣品分離效果較好;但強度較小，有機溶劑可能導致聚合物溶脹而受損，批次重復性較差，商品化色譜柱不多，一般價格較貴。

載碳量：基質表面鍵合相的比例，載碳量高，則保留增加，適合分析非極性化合物。

鍵合相：鍵合試劑不同，對化合物的選擇性不同，一般長鏈的烷基鍵合相(C18 C8)比短鏈的(C4 C3)穩定;非極性的鍵合相比極性的鍵合相(-NH2)穩定。

封端：用短鏈將裸露的硅羥基鍵合后封閉起來，以減少殘留的硅醇基，減輕待測組分與酸性硅羥基反應而引起的色譜峰拖尾現象。尤其對于極性樣品而言，未封端處理的色譜柱分離效果較差。

正相&反相色譜

目前市場上主要以反相色譜為主，約占80%的比例。

在了解了色譜柱的基本知識后，色譜柱的選擇也就迎刃而解了。

柱長及內徑的選擇

長度的選擇：柱越長，總柱效越高(n值越大)，柱越長，分析時間也越長。250—300mm是最普遍的柱長，實驗室一半以上的工作都是采用此規格柱子，一般用來分離l0到50個組份的中等至復雜混合物;500—600mm，要求較高分辨率的應用，—般用來分離大于50個組份或包含有難分離物質的復雜樣品程序升溫分析。

內徑：柱效率與柱半徑平方成反比，內徑越小柱效越高，但內徑越大，柱容量也增加，允許進樣量就越多。當進樣量超過柱容量時，則因柱內每塊理論板內不能建立真正的平衡，將會導致色譜蜂畸變，柱分辨率降低，重現性不好。因此對于復雜樣品需要精確分離，必須使用小內徑柱子。另一方面若樣品中存在具有很不相同濃度組份化合物，為了增加樣品容量就必須使用內徑大的柱子，目前實驗室使用最常見的柱子內徑一般是4.6mm。

一般選擇原則：分析大分子量化合物選擇大孔徑色譜柱;對于高pH值或者堿性化合物需要選擇高封端或者特殊封端的色譜柱，以改善峰形，延長色譜柱使用壽命等。

現在商品化的液相色譜柱琳瑯滿目，根據色譜柱的參數可以給我們提供一個初步的選擇，但由于各個儀器廠商的填料技術和鍵合技術都有差異，即使都是C18柱，同一品牌不同系列都有不同的功能，有能耐受低pH值的、有耐高溫的、有適合堿性樣品的等等。所以在選擇色譜柱前要好好研究色譜柱參數，仔細閱讀色譜柱說明書，才能找到合適的色譜柱和適宜的分離方法。