? 萌態可掬的基因編輯小豬，或許是人類器官的來源，圖片來自eGenesis
人生如同一輛汽車，剛開始的時候，性能完好，即使遇到顛簸的道路也所向披靡。隨著時間的流逝，新車變舊車，停停補補已成為常態，如果疏于對零部件的更替，那么舊車就可能會變成壞車，再也不能在公路上馳騁了。
同樣的，人的“零部件”如果壞了，就需要進行器官移植。事實上，器官移植并不是一個新鮮話題，隨著科技的進步，器官移植的成功率已經大為提高。
盡管如此，器官匱乏是當下我們仍面臨的一個嚴重問題。每年全球大概有200多萬人急需器官移植，而器官捐獻的數量遠低于需要的人群，這也導致很多科學家從山羊、狒狒、兔子甚至狗身上打起主意。經過無數次的嘗試以及失敗教訓，人們才逐漸意識到，豬可能是更為理想的器官供體。在器官的功能、大小以及可及性上，豬都是人類理想的器官供體。
但豬作為供體，面臨著兩個主要問題：一是異種器官移植所造成的免疫排斥；二是豬自身攜帶有病毒，如果將其器官移植到人體，可能會造成危害。據資料顯示，上世紀90年代，醫學研究者曾嘗試用異種器官移植的方式解決人類供體器官短缺問題，由于存在上述原因，世界衛生組織及美國政府均明確表示，在找到解決辦法之前，停止一切異種器官移植的臨床試驗。
2017年8月10日，國際頂級學術雜志《科學》發表了eGenesis公司與哈佛醫學院華人學者楊璐菡及其研究團隊的一項重要工作：成功克隆一批內源性逆轉錄病毒失活的豬（PERV-inactivated pigs）。這項工作消除了豬供體所攜帶的病毒，同時也展示出基因編輯技術對解決器官匱乏問題的推動作用。該項目是由美國eGenesis公司主導，哈佛醫學院George Church教授及云南農業大學魏紅江教授課題組合作參與。
楊璐菡出生于四川，本科畢業于北京大學生命科學學院，后師從被譽為“合成生物學之父”的George Church教授，獲得哈佛大學博士學位。2015年，楊璐菡與Church教授聯合創建了生物技術公司eGenesis，并擔任首席科學官。該公司致力于利用CRISPR/Cas9基因編輯技術為患者提供安全、有效的可供移植的組織和器官，今年3月獲得3800萬美元的A輪融資。
在這項研究中，楊璐菡及論文的第一作者牛冬等人發現，PERVs病毒在體外不僅會從豬細胞感染人的細胞，還可在人細胞之間進行傳播。該病毒一旦侵入到人體細胞中，有可能會引起免疫缺陷、腫瘤發生等健康隱患。因此，如果用豬作為器官供體，應必須清除所有的PERVs病毒。
? 如何通過基因編輯技術實現安全的器官移植，圖片來自eGenesis.com
為了得到 PERVs失活的豬個體，研究人員首先通過 ddPCR 技術結合測序技術，在原代豬胎兒成纖維細胞系（FFF3）中共找到了25個 PERVs 基因拷貝，并根據PERVs病毒的pol基因的催化核心序列，設計了兩種gRNA。研究者發現當利用CRISPR/Cas9基因編輯技術敲除掉細胞中90%的病毒時，細胞無法生長，為了防止基因編輯造成的基因損傷誘發細胞凋亡，研究人員加入了p53 抑制劑（PFTα）和堿性成纖維細胞生長因子（bFGF），從而使100%的病毒失活的細胞，仍可生長。
這些經過基因編輯技術高度修飾的原代豬胎兒成纖維細胞系（FFF3），再通過體細胞核移植技術（SCNT），即可讓誕生的豬完全不會攜帶PERVs病毒。4個月后，研究者再檢查豬的DNA以及RNA，均未發現病毒的存在。
? PERV 失活的基因編輯小豬，出生后，無論是DNA還是RNA均未檢測出病毒，圖片截自Niu et al. 2017
楊璐菡博士表示，“第一批內源性逆轉錄病毒滅活豬的產生，是異種器官移植科學研究進程的標志性里程碑。我們的團隊用新一代基因技術CRISPR/Cas9根除了豬細胞里面所有的內源性病毒活性，再通過核移植克隆技術，成功得到了沒有病毒活性的豬。這批豬的產生和健康成長，讓我們第一次從根本上解決了異種器官病毒傳染的風險。在這批豬種的基礎上，我們將繼續改造基因組以解決免疫排斥問題。”
以下為楊璐菡博士接受《知識分子》的訪談內容：
? eGenesis聯合創始人兼首席科學官楊璐菡
《知識分子》：您能大致介紹這項工作的主要發現嗎？
楊璐菡：2015年，我們在豬的癌癥細胞系PK15上，證明了滅活所有的內源性逆轉錄病毒的可能性。在過去的1-2年時間里， 我們用CRISPR 和小分子藥物在豬的原代纖維細胞實現了25個基因位點的同時打靶，之后像克隆羊多莉一樣，我們用了核移植的方法，用被基因修飾的豬纖維細胞克隆出了豬。這項工作實現了世界首例內源性逆轉錄病毒滅活小豬的創造。
從臨床應用來說， 我們從根本上解決了異種器官移植關于異種病毒傳染的風險。這批豬將是奠基性的一批豬種，今后將被繼續改造，應用到安全的異種移植臨床上。
這項工作的科學探索性也很高。內源性逆轉錄病毒在包括人類在內的所有哺乳類動物體內都存在，該病毒元件對寄主有沒有必須的生理和發育的意義，科學界對其了解也甚少。這些豬的誕生和健康成長回答了科學上一個很大的疑問，在4個月時，我們沒有觀測到修飾的小豬和正常小豬有生理上的區別。對這些豬的長期觀察，我們將為科學領域提供前所未有的關于內源性病毒可能作用的線索。
從技術創新上來講， 我們發明了CRISPR/Cas9 和小分子藥物結合處理，實現了有史以來最大規模的一次原代細胞系的基因組修飾。這個多位點基因打靶方法將在廣泛的生物制藥和醫療領域得到應用。此次生產的豬是基因修飾最多的一個活體大動物，對它們的長期觀察，將會對基因修飾和基因治療領域很多未知的安全性問題，提供答案。
《知識分子》：這項研究有沒有考慮到器官移植過程中的免疫排斥反應問題？
楊璐菡：內源性病毒滅活小豬的誕生，讓我們從根本上解決了異種病毒傳染的問題，這只是萬里長征的第一步。與此同時，我們在努力嘗試不同的基因編輯方法，提高豬的器官和人體的免疫兼容性。希望不久的將來，我們可以通過數據和科學界以及臨床領域的研究者交流和分享免疫排斥方面的進展，一起推動整個異種器官移植領域在臨床上的應用。
《知識分子》：此次很多合作機構來自中國，未來是否會考慮為中國患者提供器官來源？
楊璐菡：在豬身上進行滅活內源性病毒實驗的挑戰和未知性很高，但我們有一個勇于創新和拼搏的團隊，在過去1-2年的時間，我們完成了別人二十多年來一直探索、但沒法進行的工作。我堅信科技的力量和團隊的力量，今后會穩扎穩打，繼續推動異種器官移植的研究。在此，借這個機會感謝eGenesis 科研團隊和合作的中外機構。
中國是一個人口大國，需要接受器官移植的患者數量眾多，我們希望能做好手頭的科研工作，為全世界乃至中國的千千萬萬患者提供器官的來源和生存的希望。
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