木瓜蛋白酶由于其水解蛋白的能力較強,且具有較寬的pH和溫度適應性,所以在食品、藥品、日化等行業有較廣泛的應用。因此對木瓜蛋白酶的分離純化技術進行深入研究,提取高品質的木瓜蛋白酶具有重要的應用價值。而傳統提取木瓜蛋白酶的方法都存在一些問題,所以有必要尋找制備高品質、高活性木瓜蛋白酶的新方法。雙水相萃取技術(ATPS)是近幾年出現的、非常有應用前途的一種新型生物化工分離技術。而目前對木瓜蛋白酶雙水相萃取的研究主要集中在PEG/(NH4)2SO4和PEG/磷酸鹽雙水相系統,PEG/Na2SO4雙水相系統、金屬螯合親和雙水相系統、離子液體雙水相系統萃取木瓜蛋白酶的研究報道甚少,故實驗采取這三種雙水相系統萃取木瓜蛋白酶,并對效果進行比較。 首先采用PEG/Na2SO4雙水相系統萃取木瓜蛋白酶。考察各成相試劑及pH對木瓜蛋白酶活性的影響,研究體系中不同相對分子量PEG、硫酸鈉和PEG的質量分數、pH、酶添加量等因素對木瓜蛋白酶在兩相體系中分配行為的影響,采用響應面法優化雙水相萃取木瓜蛋白酶的最佳分離條件,并進行了實驗室規模的放大。結果表明：Na2SO4的質量分數對木瓜蛋白酶分配行為的影響極顯著,其次是PEG的質量分數,pH對分配行為的影響不顯著。得到的最佳萃取條件為：16.0%(w/w)PEG6000,18.0%(w/w) Na2SO4、pH7.0、酶添加量為1.0mg/g(酶的質量/系統的總質量)。在此條件下,木瓜蛋白酶在兩相體系中的分配系數最高可達3.1,可獲得木瓜蛋白酶活性回收率82.6%。實驗證明：響應面法優化雙水相萃取木瓜蛋白酶的條件是可行的,可用于實際預測。 其次利用金屬螯合親和雙水相分配技術對木瓜蛋白酶的萃取進行研究。考察不同無機鹽及濃度、PEG分子量及濃度、親和配基的加入量、pH、酶添加量對木瓜蛋白酶分配行為的影響,對不含親和配基的雙水相和含親和配基的雙水相萃取木瓜蛋白酶的效果進行比較,并采用響應面法優化金屬螯合親和雙水相萃取木瓜蛋白酶的條件。結果表明：親和配基的加入可以提高木瓜蛋白酶在PEG相的分配。響應面實驗結果表明：各因素對木瓜蛋白酶提取的影響順序為：PEG4000質量分數、Na2SO4質量分數、PEG-IDA-Cu(II)添加量、酶添加量、pH。優化得到金屬螯合親和雙水相萃取木瓜蛋白酶的最佳條件為：pH6.50,PEG4000質量分數為17.25%(w/w),PEG-IDA-Cu(Ⅱ)添加量為0.75%(vNa2SO4質量分數為18.0%(w/w),酶添加量為2.501mg/g。此條件下木瓜蛋白酶的酶活性回收率為93.42%,純化因子1.55,為該體系的放大試驗或規模化生產奠定了相應的試驗基礎,表明金屬鰲合雙水相分配技術分離木瓜蛋白酶是可行的。 最后采用離子液體雙水相萃取木瓜蛋白酶。首先考察了pH、溫度、各成相劑對木瓜蛋白酶活性的影響,其次考察不同離子液體雙水相體系、離子液體側烷基鏈長度及濃度、酶添加量、pH、溫度對木瓜蛋白酶分配行為的影響,采用響應面法優化離子液體雙水相萃取木瓜蛋白酶的最佳分離條件,并對萃取前后木瓜蛋白酶的結構進行表征。實驗得到各因素對雙水相萃取木瓜蛋白酶的影響順序依次為：K2HPO4的濃度、[C4mim]Cl的濃度、酶添加量、pH。得到離子液體雙水相萃取木瓜蛋白酶的最佳工藝條件：0.20g/mL的[C4mim]Cl,0.30g/mL的K2HPO4, pH7.0,酶添加量2.0mg/mL,30℃。UV-vis吸收光譜和FT-IR吸收光譜顯示,萃取前后木瓜蛋白酶的結構并未發生變化,說明離子液體雙水相的萃取萃取木瓜蛋白酶的條件非常溫和,為今后進一步研究該體系的放大試驗或規模化生產奠定了相應的實驗基礎。