雜交和數據處理實驗

Cy3－和 Cy5－標記的 cDNA 玻璃微陣列

DEPC處理的水 SDS SSC 酵母 tRNA Denhardt 溶液

熱循環儀 65℃ 水浴 芯片雜交盒 圖像分析軟件

實驗所需「材料」、「試劑」、「耗材」具體見「其他」

1. 計算所需要的雜交液體積。

計算體積的經驗是蓋玻片所覆蓋的每平方毫米載玻片面積需要 0.033 ul 雜交液。一個 24 mm×55 蓋玻片需要 40 ul 雜交液。所加的雜交液應能足以產生無氣泡的平整支撐面，這樣蓋玻片就與載玻片各處的距離一致。

2. 每個 40 的雜交體系中，將 Cy3 和 Cy5 標記的 cDNA 加入一個 0.2 ml 薄壁 PCR 管混合， 并加入 DEPC 處理過的水或用 Speedvac 蒸發儀除去一些水使它們的體積達到 30 ul。

3. 按下面所列組分配制每一份 40 的雜交體系：

芯片和樣品會有某些差異，有時有必要對雜交液組分做適當調整。如果芯片上的重復 DNA 對照有殘留的雜交信號，可以適當多加入入 C₀t－1 DNA，如高樣品封閉。如果芯片上出現彌散的背景或所有的芯片元素上發生模糊，則需加入更多的非特異封閉組分，如高陣列封閉。

4. 吹吸使所有組分混勻，在熱循環儀上 98℃ 加熱 2 min，快速降溫到 25℃，并加入 0.6 ul 10％ SDS。

5. 20～25℃ 16 000 g 離心 5 min，使凝聚的部分沉淀。

6. 把標記的 cDNA 小心地加到 24 mm×50 mm 蓋玻片上，然后與倒轉朝下的芯片相接觸。

7. 把玻片放入一個芯片雜交盒。如果盒中有池，在池里加入 5 ml 3×SSC； 如果無池，加在玻片有標記的那一端。封好雜交盒。將盒子浸入 65℃ 水浴中雜交 16～20 h。

8. 從水浴中拿出雜交盒，冷卻并仔細拭干，以免外面的水分在盒子打開時進到內部。打開雜交盒拿走玻片。

9. 將玻片和黏附在一起的蓋玻片一起放入盛滿 0.5×SSC/0.01％ SDS 洗液的 Coplin 缸內。此時蓋玻片會從玻片上落下，用鑷子撿去。玻片在缸子里洗 2～5 min。

10. 把玻片轉入另一個盛滿 0.06×SSC 的 Coplin 缸內洗 2～5 min。 根據 RNA 樣品來源不同，洗滌的程序可能需要調整以更有效地去除噪聲。第一步插入用 0.5×SSC/0.1％ SDS 洗滌或將常規的第一步洗滌重復一次都是有幫助的。

11. 將玻片轉移到玻片架上，在帶有可離心培養板的水平轉子的臨床離心機上低速離心（167 g 或 700～1000 r/min） 3 min。

根據所用型號和廠家不同，調節芯片顯像設備的細節會有很大差別。同樣地，許多方法都可以用于識別圖像中的信號、調整背景水平，以及標化兩個通道中的數值。這個部分只是想給出一些顯像中整體考慮的原則。

12. 調節光電倍增器的電壓和激光的功率使最強的信號只略低于讀數上限［如果是 16 位（16－bit scale） 那么就是 65535］，而背景值（排布的點與點之間）一致略高于 0。然后收集整個圖像的數值。

13. 將捕獲的圖像輸入數據抽取軟件。檢査雜交的整體質量：注意一致性和背景水平、信號水平和分布情況、每個通道信號的相對強度以及大多數基因信號之間的可比性如何。

除非特別說明，所有溶液用無 RNA 酶的水（如 DEPC 處理過的水） 配制。

1. 材料

玻璃微陣列

Cy3－和 Cy5－標記的 cDNA

2. 試劑

DEPC處理的水

8 mg/ml poly（dA）40－60 （Amersham Pharmacia Biotech）

4 mg/ml 酵母 tRNA

10 mg/ml 人 C₀t－1 DNA

20×SSC

50×Denhardt 溶液

10％（m/V） SDS

0.5 × SSC/0.01 ％SDS 洗滌緩沖液

0.06×SSC 洗滌緩沖液

3. 耗材

0.2 ml 薄壁 PCR 管

熱循環儀

24 mm×50 mm 玻璃蓋玻片

芯片雜交盒

65℃ 水浴

芯片掃描儀

圖像分析軟件