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  • 發布時間:2020-09-14 17:16 原文鏈接: 雜交瘤技術基本程序與方法5

    下面簡要介紹幾種常用的抗體檢測方法
     
    (1)免疫酶技術
     
    免疫酶技術是將抗原抗體反應的特異性和酶對底物顯色反應的高效催化作用有機結合而成的免疫學技術。由于它特異性強,靈敏度高,現已廣泛用于篩選和鑒定單抗。
     
    ①器材和試劑
     
    a、包被緩沖液:
     
    碳酸鹽緩沖液:取0.2mol/L Na2CO3 8ml,0.2mol/L NaHCO3 17ml混合,再加75ml蒸餾水,調PH至9.6。
     
    Tris-HCl緩沖液(PH8.0,0.02mol/L):取0.1mol/L Tris 100ml,0.1mol/L HCl 58.4ml混合,加蒸餾水至1000ml。


     
    b、洗滌緩沖液(PH7.2的PBS):KH2PO4 0.2g,KCl 0.2g,Na2HPO4?12H2O 2.9g,NaCl 8.0g,Tween-20 0.5ml,加蒸餾水至1000ml。
     
    c、稀釋液和封閉液:牛血清白蛋白(BSA)0.1g,加洗滌液至100ml;或用洗滌液將小牛血清配成5-10%使用。
     
    d、酶反應終止液(2mol/L H2SO4):取蒸餾水178.3ml,滴加濃硫酸(98%)21.7ml。


     
    e、底物緩沖液(PH5.0,磷酸鹽-檸檬酸緩沖液):取0.2mol/L Na2HPO4 25.7ml,0.1ml/L 檸檬酸24.3ml,再加50ml蒸餾水。檸檬酸溶液及配成的底物緩沖液不穩定,易形成沉淀,因此一次不宜配制過多。
     
    f、底物使用液:
     
    OPD底物使用液(測490nm的OD值):OPD 5mg,底物緩沖液10ml,3% H2O2 0.15ml。
     
    TMBS或TMB底物使用液(測450nm的OD值):TMBS或TMB(1mg/ml)1.0ml,底物緩沖液10ml,1% H2O2 25ul。
     
    ABTS底物使用液(測410nm的OD值):ABTS 0.5mg,底物緩沖液1ml,3% H2O2 2ul。
     
    g、抗體對照:以骨髓瘤細胞培養上清作為陰性對照,以免疫鼠血清作為陽性血清。
     
    h、抗原: 可溶性抗原:盡量純化,以獲得高特異性。
     
    病毒感染的傳代細胞或全菌抗原。
     
    淋巴細胞等懸液。
     
    i、酶標抗鼠抗體或酶標SPA或其他類似試劑。
     
    j、 細胞固定液:-20℃丙酮;或丙酮-甲醛固定液:Na2HPO4 100mg,KH2PO4 500mg,蒸餾水150ml,丙酮225ml,甲醛125ml;或丙酮-甲醛溶液(1;1);或-20℃甲醇。
     
    k、聚苯乙烯微孔板:40孔、96孔、或條孔;硬板或軟板均可使用。
     
    l、酶聯免疫閱讀儀;或光鏡。
     
    m、吸管、加樣器及水浴箱、離心機等。
     
    ②可溶性抗原的酶聯免疫吸附試驗(ELISA)
     
    a、純化抗原用包被液稀釋至1-20ug/ml。
     
    b、以50-100ul/孔量加入酶標板孔中,置4℃過夜或37℃吸附2小時。
     
    c、棄去孔內的液體,同時用洗滌液洗3次,每次3-5分鐘,拍干。
     
    d、每孔加200ul封閉液4℃過夜或37℃封閉2小時;該步驟對于一些抗原,可省略。
     
    e、洗滌液洗3次;此時包被板可-20℃或4℃保存備用。
     
    f、每孔加50-100ul待檢雜交瘤細胞培養上清,同時設立陽性、陰性對照和空白對照;37℃孵育1-2小時;洗滌,拍干。
     
    g、加酶標第二抗體,每孔50-100ul,37℃孵育1-2小時,洗滌,拍干。
     
    h、加底物液,每孔加新鮮配制的底物使用液50-100ul,37℃10-30分鐘。
     
    i、以2mol/L H2SO4終止反應,在酶聯免疫閱讀儀上讀取OD值。
     
    j、結果判定:以P/N?2.1,或P?N+3D為陽性。若陰性對照孔無色或接近無色,陽性對照孔明確顯色,則可直接用肉眼觀察結果。


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