1. 骨髓瘤細胞的準備
選擇生長狀態良好的細胞，渾圓透亮，大小均一，邊緣清晰，排列整齊，呈半致密分布。棄上清，以不完全培養基洗滌一次后，用10mL不完全培養基將骨髓瘤細胞（SP2/0）輕輕吹下。
2. 脾淋巴細胞的準備
a、取加強免疫后3天的小鼠，摘除眼球采血供分離陽性血清。
b、頸脫位將小鼠致死，用75%酒精消毒體表5min，隨即放入超凈臺內小鼠解剖板上，左側臥位，用7號針頭固定四肢。
c、無菌打開腹腔取出脾臟，用基礎培養基洗滌，并仔細去掉周圍附著的結締組織。
d、隨后將脾臟轉移到另一個盛有DMEM的平皿中。以彎頭針頭壓住脾臟，用小針頭在脾臟上插孔，并用鑷子擠壓，使脾細胞充分釋放，制成脾細胞懸液。
3. 飼養細胞的制備
取一只健康的ICR小鼠，摘眼球采血，頸脫臼處死，體表消毒和固定后，從大腿上剪開皮膚，暴露腹膜，酒精棉球消毒腹膜。用10mL注射器，12#針頭，注射5-10mL HAT培養基到腹腔，右手固定注射器，左手持酒精棉球輕輕按摩腹部，抽回腹腔內液體，注入已準備好的容器中。
4. 細胞融合
a、將上述制備的骨髓瘤細胞與脾細胞混合于一支50mL的帶蓋的離心管中，1000rpm離心10min，上清要充分吸凈，以免影響PEG的作用。
b、將融合管置于手掌中，輕輕振蕩底部，務使兩種細胞充分混勻。
c、用1mL吸管將預熱的PEG在45~60s內緩慢加到融合管中，邊加邊輕輕搖勻。
d、立即滴加37℃預熱的DMEM，使PEG稀釋而失去作用，具體加法是用吸管在第一分鐘內加1mL預熱的不完全培養基，第二分鐘內加2mL，第三分鐘加8mL（遵照先慢后快的原則），37℃靜置10min，1000rpm離心10min，棄上清。
e、加入5mL的HAT培養基，輕輕懸浮沉淀細胞，再加入適量的腹腔巨噬細胞，最后補加HAT至50mL左右。
f、分裝于96孔細胞培養板，然后將培養板置37℃，5%CO2培養箱內培養。
g、5d后用HAT培養基換出一半培養基。
h、觀察雜交瘤細胞的生長情況，待其細胞培養上清變黃或克隆分布至孔底面積的1/10以上時，吸取適量細胞上清進行抗體檢測。